拟南芥杂交技术

实验十三　拟南芥杂交技术

【实验目的】

掌握拟南芥杂交的方法。

【实验原理】

十字花科(Brassicaceae)鼠耳芥属(Arabidopsis)拟南芥(A. thaliana)，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。拟南芥是在植物科学，包括植物遗传和植物发育研究中的模式植物之一。拟南芥在植物学中所扮演的角色如同小白鼠在医学和果蝇在遗传学中的地位一样，被科学家誉为“植物中的果蝇”。拟南芥是自花授粉的植物。

在植物发育生物学研究中，杂交技术广泛应用，可用于分析下列问题:①获得多个基因的缺失突变体，可以由单个基因突变体杂交后获得;②分析基因间的连锁关系;③分析突变体是单基因突变还是多基因突变;④判定性状是显性还是隐性遗传;⑤分析母性遗传和父性遗传，即判定某些性状是由亲本决定的还是由父本决定的。

【实验材料】

开花期的拟南芥植株。

【实验器材】

立体解剖镜、杂交专用的尖头小镊子、手持放大镜、标记牌等。

【实验方法】

1.实验材料种植:根据不同基因型拟南芥个体生长周期的差异，相应调整种植时间，尽可能使供杂交的父本和母本的开花期相同。

2.去雄:在解剖镜下用镊子除去次日开花的母本的全部花萼、花瓣和雄蕊。一般情况下可以用解剖纸轻轻压住花蕾，用镊子仅摘掉一片花萼和一片花瓣，然后去雄。在操作熟练后甚至可以在不摘除花瓣和萼片的情况下进行去雄。

3.授粉前检查:为保证杂交成功，杂交前要确认母本的雌蕊没有授粉。在解剖镜下观察除去雄蕊的花的雌蕊柱头上是否有花粉存在，若柱头上已有颗粒状花粉，说明该雌蕊已授粉，不能作为杂交的母本，应予以去除。若雌蕊未接受其他花粉，可以作为杂交的母本。

4.授粉:用尖头小镊子小心取作为父本的雄蕊，在解剖镜下将花粉涂布在母本柱头上，并在杂交的植株旁边用标记牌作好标记，标明杂交亲本的代码。

5.鉴定杂交结果:通常柱头授粉10小时后，柱头毛失去光泽，开始萎蔫。可以依次判定杂交的成功与否。如果一次授粉不成功，可以再授一次花粉。

6.杂交后的管理:用于遗传分析的杂交实验需要数个花蕾，所以一旦确定杂交成功，就可以将母本植株上的其他花蕾除去，以保证杂交果荚能够得到足够的营养，充分发育。

7.收获种子，在28℃烘箱中干燥1周左右。去除角果果皮后将种子于4℃储存。

【注意事项】

1.母本植株中已经完成授粉的花以及角果要首先去除，减少收获种子中自交的后代。

2.母本植株的去雄一定要做完全，避免自身花粉的污染。

3.每次去雄时使用的镊子要用酒精清洗，避免花粉污染。

一、附水稻杂交方法

水稻的花器构造:栽培稻(Oryza sativa L.)属禾本科，稻属植物。稻穗为圆锥花序，其上着生小穗。穗轴有2个节，由节着生枝梗。从枝梗再生出小枝梗，其先端着生小穗。一个小穗为一颖花，由内颖、外颖、护颖、副护颖、鳞片、雌蕊、雄蕊各部分组成。内外颖:内外颖呈尖底船状，位于两护颖之间，外颖有芒或无芒，内颖一般无芒。护颖与副护颖:护颖着生于内外颖的外侧，长度一般约为内外颖的三分之一。副护颖着生在小穗轴的顶部。呈膨大的环状体。两边明显倾斜，形成极小的鳞片状。鳞片:位于外颖内侧，为扁平无色的肉质薄片，共有二枚。雄蕊: 6枚，每3个一排，着生于子房基部;花丝细长;花药分为四室，花粉粒表面较光滑呈球形。雌蕊:分柱头、花柱和子房三部分，位于颖花的中央。柱头羽状分叉，子房卵形，内有一个胚珠，为内外珠被所包着。胚珠上方有珠孔，珠被内由薄壁细胞组成的珠心，是胚珠的重要部分;珠心内有一个孕育着的卵细胞的胚囊。

二、具体方法

1.去雄:介绍两种不同的去雄方法。

(1)剪颖去雄法:选择第二天能开花的穗子，把穗上部的叶鞘剪去一部分，露出穗子，并将颖壳剪去1/3～1/4，用镊子除去雄蕊，然后套上纸袋，挂上纸牌，但这种方法易伤花器官，结实率低，一般只有5%左右。

(2)套袋机械去雄法:在开花前1小时，用黑色或褐色的纸袋，套在将要开花的穗子上，可促使其提早开花，大约提早15分钟。提早开花而花药未裂开，用镊子迅速自上而下把花药除去，这种去雄方便，且不伤花器官，但套袋的时间不容易掌握。

(3)水稻花粉与雌蕊耐温性不同，根据这一原理，选择一定温度的温水处理颖花，就可达到既可杀死花粉而不影响雌蕊生活力的目的。一般秈稻采用43℃温水浸穗5～10分钟，粳稻则采用45℃温水浸穗5分钟效果较好。具体方法是将温水水温调节好，选好稻穗，把稻穗轻轻压弯，穗子全部浸入温水中。5分钟后移去温水，取出稻穗;剪去未开花颖花。留下开花颖花。

2.授粉:在每天开花盛期，采集发育完全且刚破裂的花药作为授粉材料，用镊子夹取花药2个，轻轻塞进已去雄的小穗内，套上纸袋，挂牌。

3.检查其结实情况。

【思考题】

简要叙述在拟南芥和水稻杂交实验中的注意事项。