拟南芥胚珠透明技术

实验四十一　拟南芥胚珠透明技术——胚胎发育过程的观察

【实验目的】

1.学习拟南芥胚胎发育的一般过程。

2.掌握拟南芥胚珠透明技术的原理和操作方法。

【实验原理】

在植物胚胎发育过程中其形态经历一系列有规律的变化。早期，胚胎细胞分裂形成的一团细胞称为球形胚(globular embryo)。在这个时期，最外层的细胞形成一层表皮(epidermis)，表皮细胞通常比其下组织的细胞小。在球形胚的更深处，富含液泡的、相对较大的细胞与一簇较小的含很少液泡的细胞之间出现了分化。这些含液泡少的细胞最终将发育成维管组织(vascular tissue)，而此时这些处于未成熟状态的细胞称为原形成层(procambium)。大的细胞将发育成胚的基本组织(ground tissue)，其未分化时称为基本分生组织(ground meristem)。同时在这一阶段或更晚些时候，在原形成层束的两端出现一些具有稠密细胞质的细胞群，这些就是根和茎的顶端分生组织(apicalmeristem)的前体。根顶端分生组织在最靠近胚柄的原形成层束的末端形成，而且常常与最靠近胚体的胚柄细胞合并。茎分生组织是在原形成层中远离胚柄的另一末端形成的。

茎顶端分生组织位点附近开始形成一两片子叶(cotyledons)时，球形胚开始进入了子叶分化期。在双子叶植物中，两片子叶原基产生的同时，胚从球形变成心形，而心形胚(heart-shaped embryo)顶部的两个突起就是子叶原基。心形胚发育成为鱼雷期胚(torpedo-stage embryo)，同时保持了相同的组织器官模式。单子叶植物则不需经过心形胚时期，因为它们仅形成一片子叶。

大多数被子植物的生长在胚胎发生结束至种子萌发之前是停滞的，但是在生长停滞之前，胚胎发育的程度因物种不同而异。在发育最有限的胚胎中，茎和根的顶端分生组织形成后很快进入休眠状态。在其他物种中，这两种分生组织在休眠之前会有所生长;茎顶端分生组织长出胚芽(plumule)，而根顶端分生组织长出一段很短的根称为胚根(radicle)。在禾本科植物中，胚芽和胚根分别由保护性的胚芽鞘(coleoptile)和胚根鞘(coleorhiza)所围绕。

以双子叶植物拟南芥为例，胚胎的发育过程包括原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期、成熟胚期。

原胚期:开花后约10小时，合子(受精卵)开始第一次横向不对称分裂，形成大小不等的两个极性细胞，靠近珠孔端的为基细胞，体积较大，具大液泡，胞质稀少;靠近合点端的为顶细胞，体积小，胞质浓厚。顶细胞发育为胚体，基细胞发育为胚柄，从而建立起纵轴极性。18～24小时后，顶细胞进行两次纵向分裂，产生4细胞原胚，然后横向分裂，产生两列细胞，成为8细胞原胚。

球形胚-心形胚过渡期: 8细胞原胚再进行平周分裂，形成了原表皮层，原表皮层垂周分裂，内部先纵向，再横向，使胚胎数目与体积不断增大。同时，基细胞连续进行横向分裂，形成胚根原和胚柄。一般认为胚柄的作用是将胚推入到营养丰富的胚乳组织中，或者作为母体组织运输营养成分和生长因子到胚胎中的通道，胚柄从鱼雷胚期开始逐渐退化。

心形胚期:胚胎形态从球形胚到心形胚过渡发生巨大变化，子叶从顶端的两侧区域特化产生，细胞平周分裂，分裂频率增加，形成子叶的两个突起——子叶原基，此时胚胎由辐射对称过渡到两侧对称。

鱼雷形胚:随着子叶的发育，胚体的下部分区域开始伸长，成为鱼雷形胚。

成熟期:胚胎发育从器官模式建成转变为储存物质的积累，子叶储存物质急剧增长，此时胚的生长却不显著。

当胚胎体积增大到最大值时，便趋于成熟。细胞开始脱水，代谢活动停止，进入休眠期。胚胎在完成基本发育之后，逐渐进入休眠期的过程称为胚后发育阶段。这个过程中主要发生的事件包括:合成大量的储藏物质、诱导水分的丧失、获得干燥耐受性、防止胚胎提早萌发、启动胚胎休眠等。

【实验材料】

拟南芥不同发育时期的角果。

【药品试剂】

水合氯醛;甘油;乙醇等。

透明液配方: 200g水合氯醛; 20g甘油; 50ml蒸馏水。

【实验方法】

1.将荚果或胚珠依次放入15%、30%、50%、70%和95%乙醇中，各15分钟。

2.转入100%乙醇中约3小时，为了去除色素，通常在100%乙醇中保持过夜。

3.将荚果或胚珠依次转入95%、70%、50%、30%和15%乙醇中，各15分钟;之后，将其转入水中，15分钟。

4.将胚珠放入透明液中2～3小时，透明时间由材料的大小而定。如果是荚果，需要用解剖刀将荚果沿边缘剖开，然后再将之放在透明液中。否则透明液很难透过外皮进入荚果中。

5.如果材料需要长期保存，用树脂封片。

6.透明后的材料在普通光学显微镜或干涉差显微镜下观察和拍照。

【图例说明】

rsh是胚胎发生突变体。图5-9显示的是该突变体的表现型。上面两排图片是组织切片;下面两排图片是利用透明法在相差显微镜下观察的图像。

【思考题】

1.简述拟南芥胚胎发育的一般过程及形态特征。

2.简述拟南芥胚珠透明技术的原理和操作步骤。