微生物的制备技术

15．3．4　微生物SOD的制备技术

15．3．4．1　酵母SOD的制备技术

（1）酵母SOD菌种的培养。采用15L发酵罐，培养条件为：6%白糖、1%酵母膏、1%蛋白胨，pH为7．0，搅拌速度50r/min，发酵时间为24h。

（2）SOD的释放。离心收集湿菌体，按异丙醇∶湿菌体为9∶1（体积∶质量）用异丙醇浸泡菌体120min。抽滤除去溶剂，加入3倍体积的50mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH为7．0），搅拌120min，离心除去菌体即可得到SOD释放液。利用异丙醇浸泡酵母可选择性地释放SOD，其释放率达89%，纯化20倍以上，与传统的细胞破碎方法（如机械法及超声法）相比具有以下优点：①不需要低温或高压等复杂设备；②菌体分离容易，由于没有整体破碎细胞，在5　000r/min离心后上清液浊度比机械法破碎的上清液浊度低2倍；③可以选择性地释放，对SOD具初步纯化作用；④成本较低，浸泡菌体所用的异丙醇可回收后再次使用。

（3）中空纤维超滤浓缩SOD。用聚丙烯腈（PAN）中空纤维膜（截断相对分子质量6．0万）将SOD释放液浓缩1倍，回收率约为90%。

（4）SOD分级沉淀。将上述浓缩液用2．0mol/L盐酸调节pH至5．0，加入0．8倍体积丙酮，搅拌均匀后，5　000r/min离心除去沉淀蛋白。当pH为7．0时，加入1．5倍体积的丙酮，SOD回收率仅65%。酵母SOD等电点在4．0左右，而多数杂质蛋白的等电点在pH为4．0～5．0，因而采用降低pH至5．0来改善丙酮沉淀效果。

（5）在上清液中继续加入0．3倍体积丙酮，同法进行二次沉淀。再次用0．3倍体积丙酮，可使上清液中的SOD全部沉淀。离心收集沉淀可得纯化的SOD产物。该法工艺步骤少，操作简单，最终SOD回收率可达66%，比活约4　000u/mg蛋白（连苯三酚自氧化法测定）。

15．3．4．2　钝顶螺旋藻Fe－SOD的纯化方法

将冷冻螺旋藻溶于50mmol/L的pH为7．8的磷酸盐缓冲液中，进行超声波破碎（3min，而后1　000r/min冷冻离心10min，取上清液得粗酶液，粗酶液经35%～90%硫酸铵分级沉淀。沉淀溶解透析后上DE－FF柱进行梯度洗脱，操作在4℃下进行。接着再上CM－52柱，柱预先用pH为5．5、0．01mol/L HAc缓冲液平衡，上柱后用pH为7．8、0．05mol/L的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，超滤浓缩、脱盐后上Sephadex G－100以10mmol/L PBS（pH为7．8）洗脱，经过这几步柱分离即可得到高纯度Fe－SOD，钝顶螺旋藻SOD最后比活可达4　576u/mg蛋白，收率通常在50%左右，见表15－17。用SDS－PAGE测Fe－SOD亚基相对分子质量为21　kD，每分子亚基含0．7个Fe原子，在Tris－HCl缓冲液中的最适pH为8．2，最适温度为25℃，最大紫外吸收值为279nm，Fe－SOD对过氧化氢敏感，在5mmol叠氮钠中稳定。

表15－17　钝顶螺旋藻SOD纯化表

（摘自华东理工大学学报，2003，24（1）：20）

15．3．4．3　棕色固氮菌Fe－SOD的制备方法

取棕色固氮菌（AV－230）湿菌体300g，加入400mL 0．025mol/L pH为7．2的Tris－HCl缓冲液和60g细粉状二氧化硅，超声破碎。将所得的粗提液以15　000r/min离心20min。上清液用1mol/L NaOH调至pH为7．2，然后于56℃水浴中搅拌加热10min，迅速冷却至室温。于15　000r/min离心30min后除去沉淀。以1mol/L NaOH调上清液至pH为7．2，搅拌加入固体硫酸铵至终浓度为30%（质量∶体积），15　000r/min离心30min后除去杂蛋白。将上清液在4℃下0．025mol/L、pH为7．2的Tris－HCl缓冲液中透析除盐。

DEAE纤维素－52柱层析（以下层析均在4℃下进行）。将除盐样品以30mL/h的流速上至以0．025mol/L、pH为7．2的Tris－HCl缓冲液平衡好的DEAE－52柱上，以0～0．15mol/L NaCl的相同缓冲液进行梯度洗脱，收集活性部分浓缩冻干。

Sephadex G－75柱和羟基磷灰石柱层析。将冻干粉末溶于10mL 0．020mol/L pH为8．2的Tris－HCl缓冲液中，分两次加入已用同样缓冲液平衡过的Sephadex G－75柱上，流速为20　mL/h，以同样缓冲液洗脱。

经Sephadex G－75柱层析后的样品，透析除盐后冻干，溶于4mL 5mmol/L、pH为6．8的磷酸缓冲液中，加入用同样缓冲液平衡过的羟基磷灰石柱上。以5～15mmol/L、pH为6．8的磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集活性组分。将活性部分透析除盐后冻干即得Fe－SOD纯品。各步纯化结果见表15－18。

表15－18　棕色固氮菌Fe－SOD纯化表

（摘自生物化学杂志，1988，4（3）：193－195）

15．3．4．4　从大肠杆菌中提取SOD（Fe－SOD）

Fe－SOD一般存在于需氧的原核生物中，也存在于少数真核生物如细致虫藻与芸苔中。它的酶蛋白性质类似Mn－SOD，故其纯化方法大致与Mn－SOD类似。Yost与Fridovich首先从大肠杆菌中分离出Fe－SOD，随后其他菌藻如间隔发光杆菌、leignachi发光杆菌、脱氮副球菌、结核分枝杆菌、卵状假单孢菌、嗜硫代硫酸盐绿菌、酒色着色菌、脱硫弧菌、巨大芽孢杆菌、烷杆菌以及织线藻中也分离出该酶，甚至还得到结晶。所有的分离方法虽有一些不同，但大体类似。现以大肠杆菌Fe－SOD为例介绍该酶的纯化方法。

（1）破碎细胞。取300g大肠杆菌悬浮于1　500mL的pH为7．8、0．05mol/L磷酸钾缓冲液中。在0℃～5℃中用超声波发生器使大肠杆菌破碎。以13　000r/min离心30min，除去沉渣，收集上清液。

（2）链霉素硫酸盐处理。在上清液中加入链霉素硫酸盐，使其浓度为2．5%。在23℃搅拌30min，离心，收集上清液。

（3）50%硫酸盐处理。在23℃缓慢加入硫酸铵至上清液中，使达到50%饱和。1h后离心，收集上清液。

（4）75%硫酸盐处理。按照上述步骤，在上清液中继续缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到75%。放置1h后离心除去上清液，保留沉淀。

（5）透析。将沉淀溶于最小量的pH为5．5、0．002mol/L醋酸钾缓冲液。在冷室中用同样缓冲液透析48h左右。

（6）CM－52层析。取CM－52柱，预先用pH为5．5、0．01mol/L醋酸盐缓冲液平衡。将上述透析液上柱。Mn－SOD仍在柱中被吸附，但Fe－SOD可被洗脱，用pH为7．8、0．05mol/L磷酸钾缓冲液透析。所有操作应在4℃进行。

（7）DE－52柱层析。预先用pH为2．8、0．005mol/L磷酸钾缓冲液使DE－52柱平衡。将上述透析液上柱，用同样缓冲液200mL洗柱，并以500mL的0．005～0．05mol/L同样pH缓冲液进行梯度洗脱，测定收集管的蛋白质含量及酶活性。将符合纯度要求的收集、合并和浓缩，冷冻干燥即得Fe－SOD成品。