微生物纯培养技术

微生物在自然界中不仅分布广，而且种类多，并多是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的纯培养。微生物学中将在实验室条件下由一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为微生物的纯培养。

纯培养技术包括两个基本步骤：① 从自然环境中分离培养对象。 ② 在以培养对象为唯一生物种类的隔离环境中培养、增殖，获得这一生物种类的细胞群体。针对不同微生物的特点，有许多分离方法，应用最广的是平板法分离纯培养。

（一）平板分离法获得纯培养

平板法采用Petri培养皿（简称培养皿），它是一副互扣的平面盘。互扣的培养皿经过灭菌，内部保持无菌。将经过灭菌的固体培养基注入无菌的培养皿中，制成固体培养基平板。

例如葡萄汁发酵为葡萄酒主要是酵母菌的作用，但葡萄汁中实际存在着以酵母菌占绝对优势的多种微生物。用无菌水系列稀释葡萄汁，将少量不同稀释度的稀释液分别接入适合酵母菌生长的平板培养基中，在适宜温度（25～30℃）中培养，结果在适宜稀释度的培养皿中就会长出许多孤立的单菌落，其中大多为酵母菌菌落。将由单一种酵母菌形成的菌落作为接种物，接种到适宜的斜面培养基上，反复多次可获得酵母菌纯培养物。大多数情况下，这种分离纯化需要进行多次，才能获得纯培养。具有不同特性的微生物在不同环境中生存，往往需要特殊的分离、培养方法。

（二）富集培养

有些微生物在自然界中生存着，但分离和获得纯培养却十分困难，有些甚至至今没有成功过。对于这些微生物，常采取富集培养的方法，作为纯培养的前处理，或者直接以富集培养物作为研究材料。例如，亚硝酸细菌和硝酸细菌，它们中的有些种类是经过很艰难的操作过程才得到纯培养的，有些种类迄今还没有得到纯培养物。但得到它们的富集培养物却比较容易，对于它们的特性和在自然界中作用的知识，主要是从研究它们的富集培养物获得的。

富集培养作为取得纯培养的前处理，使特定的微生物种类在数量上占绝对优势，然后稀释培养在适宜的平板培养基上，长出的单菌落多数是预期要分离的特定目标种类。

（三）二元培养

二元培养是纯培养的一种特殊形式。有些寄生微生物只能在寄主微生物体内寄生，必须将寄生微生物和寄主微生物培养在—起，同时排除其他杂菌。例如噬菌体只能在特定的寄主微生物体内繁殖。首先在平板培养基中繁殖寄主微生物的纯培养（称为细菌坪），再将含噬菌体的稀释液接种在细菌坪上，经过培养，在细菌坪上出现许多独立的噬菌斑，反复纯化，得到纯的二元培养体即只有一种寄主细菌和一种噬菌体的“纯培养”。

（四）共培养物

如在沼气发酵过程中，对分解丙酸、丁酸和长链脂肪酸的产氢产乙酸细菌的分离，必须在厌氧条件下和利用H2的细菌如脱硫弧菌（Desulfovibrio）或产甲烷古菌共同培养下才能获得二元培养物。采用严格的厌氧培养技术，沼气发酵液以10倍系列稀释，接种到无氧的、已融化的含丁酸（或丙酸，或某一长链脂肪酸）的适宜固体培养基的培养管中（培养管用丁基橡胶塞密封），立即摇匀，在冰水浴中均匀地旋转培养管，使琼脂培养基在试管内壁凝固成一均匀透明的琼脂薄层（此法称滚管法）。然后在30～35℃培养，经过15天后可见单个菌落，挑取单个菌落并稀释，再行滚管培养，直至培养管中只有一种形态的单菌落出现，该单菌落中就是由一种分解丁酸（或丙酸，或某一长链脂肪酸）的产氢产乙酸细菌和一种利用H2的细菌组成，最终获得共培养物。在互营共培养物中，有些不仅仅含有2种不同种类的微生物，可能有3种或4种，甚至更多种类的微生物，它们之间实际上组成了一个以利用某种基质为起点的生物链。