染色体制备技术

染色体（chromosomal）是生物遗传物质的载体。昆虫染色体的研究可丰富昆虫遗传学的理论内涵与知识体系，用于揭示昆虫的种类演替、种间进化、种内进化的客观规律，为昆虫分类系统建立、近缘种区分乃至种下分类提供新方法和技术，并指导害虫的遗传防治，也为探明昆虫抗药性形成的机制提供新的途径。

昆虫染色体的研究，包括分析染色体核型、有丝分裂、减数分裂、特殊染色体、染色体结构与数量变异等。截止2002年底，中国昆虫染色体研究涉及的昆虫种类共计10目481种，包括蜉蝣目、蜚蠊目、直翅目、半翅目、同翅目、鳞翅目、双翅目、蚤目、鞘翅目及膜翅目。

（一）染色体标本制备

孙红英（1998）探讨了蜉蝣目昆虫染色体制备方法探讨，具体方法如下：

1．预处理和取材　将昆虫稚虫置于0．025%秋水仙碱水溶液中，室温下预处理18h。显微镜下将稚虫腹面向上，去除头部，用解剖针按住胸部末端，另取一针压住腹部后段，顺势往后拉出肠管及其两侧生殖腺，再用解剖针将生殖腺分离。

2．低渗、固定　将生殖腺移至滴有低渗溶液的载玻片上，用解剖针将组织块尽量分散，并用毛细吸管轻轻吹打．使之成细胞悬液。经蒸馏水低渗40min，操作时，及时补充低渗溶液，以免材料干燥。用毛细吸管将上述细胞移入新鲜配制的甲醇、冰醋酸（3∶1）固定液固定处理60min。每隔10min更换1次固定液。

3．空气干燥法制片　取预先制冷的洁净载玻片，用毛细吸管吸取细胞悬液滴片，将玻片迅速在酒精灯上过焰几次，倾斜置于避尘处晾干保存。

4．染色　用稀释10倍的Giemsa（pH6．6～6．8）扣染30～40min，蒸馏水冲去多余染液，空气干燥。

赵素然（2005）介绍了一种摇蚊涎腺染色体永久封片的制作方法，具体如下：

①剥离幼虫涎腺。②将剥离后的腺体在室温下用解离液（HCl∶95%乙醇＝1∶1）水解20s左右，用滤纸条吸干盐酸溶液，再滴1滴清水或低渗液，约1min后用滤纸条吸干。重复3～4次，洗净残留的盐酸。室温下用改良苯酚品红溶液染色10～20min，然后压片。取一片干净的盖玻片和一个双面刀片，盖片时在盖玻片和载玻片间边缘处放一双面刀片，在盖玻片上用解剖针柄轻轻敲压，使盖玻片和载玻片间的液体流动，靠流动的力量将染色体臂伸展开，待将染色体完全压散后（没有红色），将刀片取出，再用中指轻轻压片，使细胞充分分散。③封片：用适当温度的水浴光学树脂胶融化，黏度以挑起时不拉长丝为佳。用探针挑取光学树脂胶均匀涂抹于盖片四周封住盖片，注意勿搓动盖片。烘干或晾干即成为一张永久封片。

（二）染色体分带（chromatosome banding）技术

自20世纪60年代末Q带技术得到应用以来，已相继建立了许多常规的染色体分带技术，主要是利用特殊的染色程序使得染色体的一定部位呈现出深浅不同的染色带，如A带、C带、D带、G带、N带、R带、T带、银染以及一些经过特殊处理的混合带。我国昆虫染色体研究中以C带最为常见，另外G带也在蜚蠊目、直翅目、双翅目的核型分析中被成功应用。

C带操作程序特别能使着丝粒型的异染色质着色，常用BSG法，即Ba（OH）2－盐溶液－Giemsa法。G带可以通过酸处理、碱处理、蛋白酶消化、蛋白变性、EDTA处理及氧化处理等分别获得。近年来又有报道用限制性内切酶分带等，为进一步研究染色体结果和基因定位等提供了新的手段。我国昆虫染色体分带技术的充分利用及进一步深入分析细胞遗传学规律与国外相比还有差距，还有待深入。

郭亚平等（1997）把C语言的绘图优势和FoxPro强大的制表优势结合起来，通过输入实验测量的有关数据，显示和打印出蝗虫C带带型的示意图，并显示和打印出数据的统计表，以便于同模式图进行对照分析，且可将有关数据进行贮存，该程序稍作改动后可推广到其他动植物的C带以及其他带型示意图的绘制中。

朱翔等（1995）采用染色体G显带的方法对国内首次建立的埃及伊蚊细胞系（Aacg1289）进行细胞遗传学研究。结果表明，在染色体臂上显示清晰的深浅带，正中期染色体有58条带，同源染色体可准确配对。初步建立了埃及伊蚊G带带型模式图，确定早中期染色体有96条带。

（三）染色体特征分析方法

染色体特征分析多采用常规光学显微摄影的方法，此外也有利用扫描电镜和透射电镜分析染色体核型、联会复合体结构、染色体轴结构、易位、倒位、多线染色体、B染色体、遗传变异行为及规律的报道。另外现在已利用专业分析软件来处理数据，以求精确分析昆虫染色体核型和细胞遗传学特征。

蓝明扬等（1992）用单个中华按蚊雌蚊卵巢建成的细胞系制备高质量染色体并且进行了G、C分带。核型分析结果表明双倍体细胞由3对染色体组成。两条X染色体的长臂不等长，长臂较短者（X1）为亚中着丝粒，长臂较长的X染色体（X2）和Ⅱ号、Ⅲ号常染色体均为中着丝粒染色体。细胞收获前用5－溴尿嘧啶处理，胰酶消化G带可显示丰富的带纹，类似于一般动物的G带带型，常染色体在着丝粒区为C带阳性，X1染色体为长臂阳性，X2长臂的近着丝粒端为阳性，末端有阴性带。

（四）染色体技术在医学昆虫中的应用

1．分类　是目前研究的主要应用，利用有丝分裂染色体的核型、分带染色染色、多线染色体标本进行图型分析，作为分类依据。主要用于研究种属鉴定及近缘种、种群演化、昆虫性别决定机制及染色体的种内多态现象。

许漱壁等（1991）观察了我国13种按蚊脑有丝分裂染色体核型及异染色质带，结果表明：常染色体异染色质数量及分布的差异是按蚊分类特别是近似种鉴别的有效手段；我国多斑按蚊和大劣按蚊分别为多个近似种组成的复合种团；赫坎按蚊、中华按蚊和嗜人按蚊的多线染色体的主要差异是在于固定性臂内倒位。

2．遗传防治及杀虫剂抗性研究　目前许多媒介昆虫的抗药性和抗性的控制基因的携带染色体已明确，通过原位杂交即可确定这些基因在染色体上的精确位置，这不但能促进昆虫基因图和连锁图的构建，且可利用微切或激光切割及染色体步移技术，取得这些基因的DNA克隆。例如，在致乏库蚊中已分离、克隆出对有机磷抗性的酯酶基因，若把抗性基因借助基因插入技术转移到抗病原体的蚊虫中，然后大量释放这种转基因蚊虫，同时在现场中喷洒相应的有机磷杀虫剂，就会使这种非病媒蚊虫最后取代病媒蚊虫。