外源染色体上找抗源_关于刘大钧的故事

外源染色体上找抗源_关于刘大钧的故事

染色体工程（Chromosome engineering）最早是由里克（Rick）和库升（Kush）在1966年提出来的。植物染色体工程的用途很广，其中最重要的是基因定位和异源基因的导入。用导入异源基因改良现有小麦品种是小麦育种的重要方向之一。

对大赖草的研究

大赖草［Leymus racemosus（Lam.）Tzvel，2n=28，基因组NNJJ］又称巨大冰麦草，属禾本科披碱草属，多年生，分蘖能力中等，叶片狭长并较坚硬，叶色较深，叶脉突出，穗状花序，小穗含有3~5朵小花，外颖呈锥形，上有3~5条脉，脉上粗糙，先端延伸成芒，芒向外展开。刘大钧团队分别在田间和室内对大赖草进行抗赤霉病性鉴定。开花前后对穗部进行赤霉病禾谷镰刀菌孢子悬浮液单花注射接种，在温室条件下，保持25~30℃，相对湿度95%以上。接种后第14天记载发病情况。试验结果表明，大赖草穗部仅接种小穗发病，但未见有扩展现象，其余小穗均未感染。按南农植病组所定标准，大赖草对小麦赤霉病的抗性鉴定为高抗（注：王耀南、陈佩度、刘大钧：《巨大冰麦草种质转移给普通小麦的研究——普通小麦×巨大冰麦草F1的产生》。《南京农业大学学报》，1986年，第9期，第10—14页。）。

早在1985年，刘大钧团队就曾获得（普通小麦“中国春”×大赖草）F1植株，其后又获得了（普通小麦×大赖草）普通小麦回交后代，第1、2次回交结实率分别为2.7%和21.2%。其回交植株用强菌株混合液接种鉴定，均分离出赤霉病抗性明显高于对照品种的植株，表明将大赖草的赤霉病抗性导入普通小麦是可能的，由此而创建比现有普通小麦抗病品种更加抗赤霉病的育种材料也是有希望的。刘大钧团队在实验过程中也关注到赤霉病抗性转移过程中怎样防止抗性减弱或丢失问题。

随后，刘大钧团队又通过对普通小麦×大赖草第二至第五代回交杂种（BC2F2-BC2F5）进行赤霉病抗性和细胞遗传学鉴定，选育抗病异附加系。经离体和活体赤霉病抗性单花滴注鉴定和有丝分裂中期及PMC MI的C-分带分析，选育出添加了1对第2染色体的抗赤霉病异附加系。除育成抗病的二体附加系外，刘大钧团队还选出添加1个或1对端着丝粒染色体的抗赤霉病植株和一些2n=42的抗病植株。(www.guayunfan.com)大多数学者认为，普通小麦中的赤霉病抗性受2~3个主基因和若干修饰基因控制。刘大钧团队在其后几年的实验中，得出初步结果：在大赖草中至少也有3对染色体与赤霉病抗性有关。在第2条染色体上的抗病基因比第7和第14条染色体上基因的抗性强。在涉及同一对外源染色体的不同株系中还看到赤霉病抗性有一定差异，这似乎表明它们可能还受到修饰基因的影响。由于小麦赤霉病抗性遗传受多个基因控制，呈加性效应，因而通过选育添加或代换一对外源染色体转移赤霉病抗性的方法，很可能还不足以使它们保持亲缘物种所具有的抗性水平。为此，刘大钧团队也一直在尝试通过不同抗病附加系间互交并结合花药培养的方法选育双重或多重附加、代换和易位系，以保持较高的抗性水平。

随着花药培养方法和培养条件的改善，小麦花粉绿苗的获得率有了大幅度的提高，因而人们逐渐将这一技术与染色体工程结合起来。由于花粉植株有其独特的遗传学特征，用远缘杂种后代进行花药培养，不但为创建异附加系提供了新的方法，提高了创建异附加系的频率，而且时间短、效率高。从亲缘物种向小麦转移多基因控制的性状（如赤霉病抗性）时，显然要比转移单基因控制的性状难度大，如果仅选育设计一条外源染色体的抗病异附加系、异代换系和易位系，可能会因其携带抗病基因染色体的丢失而导致抗病性低于亲本原有水平。用抗病植株间互交并结合花药培养，创建涉及到多条外源染色体的异附加系、异代换系和易位系，使位于不同染色体上的抗病基因聚合起来，就有希望创造出保持较高抗性、农艺性状较好的中间材料。刘大钧及其团队还尝试使用花药培养法寻找和创制普通小麦与大赖草的双重二体异附加系和代换-附加系。通过普通小麦“中国春”与抗赤霉病的亲缘物种大赖草杂种回交后代BC2F3和自交F4代的花药培养，获得了72株花培植株，其中28株结实。这些株系的株高、穗型和成熟期等性状在H2系间差异明显，但株系内整齐一致。通过PMC MI染色体配对分析和染色体C-分带，在H2代中选育出一个异代换-附加系（2n=44），两个双重二体异附加系。但遗憾的是经初步鉴定这3个材料的赤霉病抗性仍不高，因此，需要将花药培养中的出愈率、绿苗分化率和绿苗产率进一步提高，创造较大的再生植株群体，或进行附加系间互交、不同亲缘植物远缘后代间互交，丰富产生配子的类型。大赖草染色体经C-分带处理后大多显示很强的末端带，很容易将异附加系鉴定出来。该研究在对L07的花粉母细胞染色体进行C-分带处理时发现，中期Ⅰ出现的单价体和后期Ⅰ出现的落后染色体，既有大赖草染色体又有普通小麦本身的染色体。因而采用花粉母细胞染色体C-分带，不仅可以鉴别外源染色体，而且还能观察外源染色体在普通小麦背景中的配对行为。

对鹅观草的研究

鹅观草属（Roegneria）是优良的禾谷类牧草，广泛分布于东亚，具有多花多粒、耐湿、高抗赤霉病等优良特性。通过对小麦及其远缘物种的赤霉病抗性鉴定表明，鹅观草（Roegneria kamoji Ohwi，2n=42，基因组SSHHYY）和纤毛鹅观草（Roegneria ciliaris Keng，2n=28，基因组SSYY）对赤霉病抗性最好。如何通过染色体操作有效地转移鹅观草的抗病基因并创造在育种中较易被利用的种质材料，从1986年开始就成为刘大钧团队的研究目标，其研究思路与对大赖草的研究一样，遵循这样一种顺序：种间或属间杂交→F1或产生双二倍体→异附加系→异代换系→易位系。一开始刘大钧团队利用它与普通小麦进行属间杂交，杂交组合如：纤毛鹅观草（♀）×普通小麦“中国春”（♂）、“中国春”（♀）×鹅观草（♂）以及鹅观草（♀）ד中国春”（♂）。运用根尖细胞染色体计数表明前两个组合F1均具有预期的染色体（分别为2n=35和2n=42），而鹅观草（♀）和“中国春”（♂）F1中除2n=42的预期类型外，还发现2n=63的异常类型。预期类型F1形态均呈中间型，2n=63异常类型偏向于“中国春”（注：翁益群，刘大钧：《鹅观草与普通小麦属间杂种F1的形态——赤霉病抗性与细胞遗传学研究》。《中国农业科学》，1989年，第22卷，第5期，第1—7页。）。

上述配制的所有F1均完全雄性不育，经离体接种鉴定表明，它们对赤霉病仍然表现高抗，用“中国春”对其F1进行回交，所有F1均获得BC1代。鹅观草与“中国春”（2n=42）的正反交F1回交结实率存在明显差异，以鹅观草为母本的F1回交结实率很低，BC1仍然需要采用幼胚培养方法才能获得回交植株。通过对正反交属间杂种及回交世代的比较表明，鹅观草的细胞质对回交后代存在明显的不利效应，如幼胚早夭、胚乳退化、干瘪或无生活力、种子不能发芽、死亡或生活力弱、植株不育等。因此，刘大钧团队认为，要从鹅观草向普通小麦转移有用基因，获得具有普通小麦细胞质背景的杂种或回交后代是必要的（注：翁益群，陈佩度，刘大钧：《从鹅观草属物种（Roegneria C.Koch Spp.）向普通小麦转移赤霉病抗性的研究》。《中国的遗传学研究》，中国科学出版社，1991年。）。

1995年，刘大钧团队在充分应用根尖细胞染色体计数、花粉母细胞减数分裂染色体配对构型分析、植株外形特征观察以及染色体C-分带技术的基础上，在普通小麦-鹅观草的杂交及回交后代中初次选育并鉴定了3个鹅观草的二体异附加系。这3个异附加系分别添加了1对鹅观草1号、13号和8号染色体，在形态特征以及结实率方面与“中国春”有所不同，原因可能有两个方面：随着杂交及回交世代的增高，后代中的鹅观草染色体逐渐被排斥，致使植株外形也趋近于“中国春”；添加的鹅观草染色体本身对表型的影响较小，或者在小麦遗传背景中得不到表达，但就群体来看，杂交及回交后代的表型，尤其是穗形仍是十分丰富，达23种之多，而且这些表型明显地不同于双亲，显然它们涉及到不同的遗传型。以植株外部形态特征观察为辅助手段选育异附加系等，可大大简化选育工作，同时有利于种质的保存。鹅观草染色体总体上要比普通小麦的染色体小，而且这两个物种的染色体C-分带带型不同，可彼此区分，所以应用C-分带方法结合其他常规方法鉴定普通小麦-鹅观草异附加系是有效的。至于鹅观草本身的染色体组的划分、同源染色体群的归属问题可用C-分带技术、同工酶分析和分子标记等方法加以确定。

对其他近缘植物的研究

刘大钧团队除对簇毛麦、大赖草、鹅观草进行研究外，还对小麦的其他近缘属约20多个植物物种进行过研究，它们分别是：大麦属（Hordeum Linn.）、黑麦属（Secale）、山羊草属（Aegilops spp）、披碱草属（Elymus spp）、偃麦草属（Elytrigia spp）和旱麦草属（Eremopyrum）。研究结果证实了墨西哥国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）所报道的大赖草对赤霉病有很好的抗性，并发现广泛分布于长江中下游地区鹅观草属的两个物种纤毛鹅观草和鹅观草对赤霉病有强抗性（注：刘大钧：《向小麦转移外源抗病性回顾与展望》。《南京农业大学学报》，1994年，第17期，第1—7页。）。

图7-5　刘大钧（右一）在实验室工作照片（左一：以色列遗传育种专家Dr.Feldman，左二：李万隆）

刘大钧在1994年发表的《向小麦转移外源抗病性回顾与展望》中总结说：在1984—1994年，南京农业大学细胞遗传研究所在转移外源抗性研究中已获得了硬粒小麦-簇毛麦双倍体、普通小麦-簇毛麦双倍体、普通小麦-簇毛麦染色体6V二体附加系和普通小麦-簇毛麦染色体6V二体代换系、普通小麦-簇毛麦（6AL/6VS）易位系、普通小麦-大赖草二体附加系、普通小麦-鹅观草二体附加系和普通小麦-纤毛鹅观草二体附加系（注：刘大钧：《向小麦转移外源抗病性回顾与展望》。《南京农业大学学报》，1994年，第17期，第1—7页。）。

10多年来，刘大钧总结其转移外源抗性的研究工作，主要经验有：

（1）这一研究既是一项十分有意义的工作，又是一项十分艰巨的任务。其重要性与意义不仅在于它能解决育种工作所紧缺的基因资源，而且更在于所创造的种质往往在利用过程中还可发现其未曾预料的（其中特别是易位系）价值。另外，这一研究所创造的各类材料除其实际的育种应用价值外，对于许多基础研究也有其不可替代的特殊用途。这在小麦的许多生化标记和分子标记的定位中已被证明。

（2）在转移外源抗性的研究工作中，对外源染色体、染色体片段及所携带的外源抗性基因的准确有效的鉴定十分重要。因为鉴定是筛选的基础，也是科学验证的依据。而鉴定既涉及抗性又涉及外源染色质或外源DNA，因此所需技术较多，必须正确掌握与恰当应用。值得一提的是各种鉴定技术的综合应用和所获结果的相互验证。因为只有这样才能真正取得不仅知其然而且多少能知其所以然的研究结果。

（3）转移外源抗性研究实际是一个逐步深入的过程。过去的研究成果往往为后一阶段研究提供线索和奠定基础（注：刘大钧：《向小麦转移外源抗病性回顾与展望》。《南京农业大学学报》，1994年，第17期，第1—7页。）。