病毒的培养及检测

实验九　病毒的培养及检测

一、目的要求

1．了解病毒的培养方法。

2．熟悉病毒常用的检测方法。

二、实验原理

病毒是一类体积微小、结构简单、仅含一种类型的核酸，不能独立进行代谢活动，只能在合适的活细胞内生长繁殖的非细胞型微生物。

病毒的大小、形态、结构等一般需在电子显微镜下才能观察到。在某些受病毒感染的细胞内，用普通光学显微镜可看到大小和数量不同的圆形或不规则的小体，称为包涵体。不同病毒包涵体的形态、大小、组成及在细胞内的位置、染色性等各不相同，在病毒的鉴别及病毒类疾病的诊断上具有一定的意义。

病毒必须在易感的活细胞中寄生，由宿主细胞供给其合成的原料、能量与场所才能增殖。常用的病毒培养方法有动物接种、鸡胚培养及组织（细胞）培养3种。目前常采用单层细胞培养法进行病毒的培养及鉴定。常用的组织细胞有各种动物（猴、兔、人胚等）的肾脏组织，此外，还可用羊膜、鸡胚、Hela细胞等。

实验室常用中和试验、补体结合试验、红细胞凝集抑制试验等血清学试验方法检测病毒抗体；近年来应用免疫荧光技术、酶联免疫吸附技术、间接红细胞凝集试验等检测病毒抗原或抗体，已成为实验室病毒感染诊断的常规技术。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因组织构、序列同源性比较加以鉴定。

三、实验内容及方法

（一）病毒包涵体（内基氏小体）的观察

（1）材料。

狂犬病毒内基氏小体标本片、显微镜。

（2）方法。

在显微镜下用油镜观察标本片，镜检可见在三角形的神经细胞的胞浆内有红色卵圆形的斑块，即狂犬病病毒所致的包涵体——内基氏小体。

（3）结果记录及分析。

观察内基氏小体，绘示意图。

（二）病毒的培养和检测技术

1．HSV的组织培养法（示教）。

（1）材料。

HSV、Hela细胞。

（2）方法。

将长好单层细胞的培养板各孔培养液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的HSV病毒液从低浓度开始，依次加入各微孔中，每稀释度平行加4孔，每孔100μL。

细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。置37℃，5%CO₂孵箱中孵育18h，24h，36h，96h。

（3）结果记录及分析。

在倒置显微镜下观察细胞病变效应（CPE），病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落现象。在观察整个“单层区”，以发生CPE细胞比例表示其程度，并以下列符号记录结果。

－：无CPE。

＋：1/4以下有CPE。

＋＋：1/2的细胞有CPE。

＋＋＋：1/2～3/4的细胞有CPE。

＋＋＋＋：3/4以上的细胞有CPE。

2．流感病毒的鸡胚接种及滴度测定。

（1）材料。

毒株：H1N1流感病毒。

其他器材：受精鸡卵、0．5%鸡红细胞、生理盐水、注射器及针头、锉刀、钢锥、无菌石蜡、盖玻片、毛细滴管、橡皮帽、2．5%碘酒、75%酒精、无菌棉签、照蛋灯、蛋架、布手套、无菌平皿、镊子、酒精灯。

（2）方法。

孵蛋：选择种蛋，39℃孵育，每日翻动2～3次；孵育4～6d后，用照蛋灯观察鸡胚情况，未受精者只见一团黑影，受精卵则与孵育后出现血管及活动的胚胎。

接种（以尿囊接种为例）：10～11d鸡胚，划出气室及胚胎位置，于胎旁无大血管处用铅笔画记号，作为接种处。消毒后用钢锥在接种处锥一小孔，针头由小孔插入，向鸡胚方向，深入0．5～1cm，注射约0．1～0．2mL毒种，接种毕以热蜡封口。置35～37℃培养，24h内死亡者弃之。如图2－7所示。

收获：收获前，将卵置4℃4h或过夜。在无菌操作条件下，以镊子敲破气室端，除去卵壳和卵膜，卵斜立固定，从绒毛尿囊膜上无大血管处穿破进入，用无菌滴管吸取尿囊内尿囊液，约可得5～6mL，置于无菌小瓶内，冰冻保存。

图2－7　鸡胚接种的各种途径

1．绒毛尿囊膜接种；2．壳膜；3．气室；4．羊膜腔；5．卵黄囊接种；6．尿囊膜接种；7．绒毛尿囊膜；8．尿囊腔；9．白蛋白；10．壳；11．羊膜腔；12．卵黄囊

鉴定及滴度测定：取小试管9支（或采用塑料凹孔板），于第1管加入生理盐水0．9mL，其余各管均加入0．25mL。于第1管注入羊水或尿囊液0．1mL，充分混匀，吸出0．75mL，于第2管注入0．25mL，其余0．5mL弃入消毒液中（切不可乱弃）。从第2管起对倍稀释至第8管。各管加入0．5%鸡RBC 0．25mL，摇匀后室温静置60min。30min、45min、60min各观察结果一次，以45min结果为准。

（3）结果记录及分析。

“－”表示不凝集，红细胞沉积于管底，呈边缘整齐的圆盘状。

“＋”表示微量凝集，红细胞沉积于管底，呈边缘不清晰的圆盘。

“＋＋”表示凝集，红细胞沉积于管底呈环状，四周有凝集的小块。

“＋＋＋”大部凝集，红细胞呈颗粒状凝集，边沿有下垂趋势。

“＋＋＋＋”完全凝集，红细胞呈网状平铺于管底。

对照管应不凝集。依次观察实验管。以能使发生“＋＋”凝集的病毒最高稀释度为凝集效价。

四、思考与讨论

1．阐述轮状病毒的核酸类型及病毒形态。

2．病毒培养的方法有哪些？