细菌的生化反应

时间：2022-05-07 理论教育版权反馈

【摘要】：微生物的生理生化反应是指用化学或生物化学方法检测细菌的代谢产物。生理生化反应可鉴别一些在形态和其他方面不易区分的微生物。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即V－P反应是阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化试验。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。

实验八　细菌的生化反应

一、目的要求

1．了解细菌的各种生理生化反应。

2．学习利用细菌的生理生化反应进行鉴别。

二、实验原理

不同的细菌具有的酶系统各不相同，对营养物质的利用能力各异，它们在代谢过程中所产生的代谢产物也不同。微生物的生理生化反应是指用化学或生物化学方法检测细菌的代谢产物。生理生化反应可鉴别一些在形态和其他方面不易区分的微生物。因此，微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

三、实验内容及方法

（一）对糖的代谢

1．糖发酵实验如图1－10所示。

有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠埃希菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH 6．8）变为黄色（pH 5．2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、痢疾志贺菌、待检菌斜面各1支。

培养基：葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）。

图1－10　糖发酵试验结果

（2）方法。

用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。

取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入细菌。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样接入菌。接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。

将接种过的试管置37℃培养箱中培养24～48h。

（3）结果记录及分析。

观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。紫色变为黄色，说明培养基变成了酸性，糖类被分解产酸；培养基不变色说明，糖类没有被分解。倒置的德汉氏小管中有气泡，说明糖类分解时能产生气体；没有气泡，说明不产生气体。

记录实验现象，判断各菌的糖发酵结果。

2．氧化－发酵试验（O－F试验）。

又称Hugh－Ldifson（HL）试验。细菌在分解葡萄糖的过程中，依据对分子氧需求的不同，可将细菌分为不同的代谢类型。必须有氧分子参加的，即仅在有氧的环境中分解葡萄糖，在无氧条件下不分解糖的细菌称为氧化型（O型）；有或无氧分子参与均能分解葡萄糖的细菌为发酵型（F型）；有或无氧分子参与均不分解葡萄糖的细菌成为产碱型。

（1）材料。

菌种：铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、待检菌各1支。

试剂：葡萄糖氧化发酵管（Hugh－Leifson培养基）。

（2）方法。

无菌穿刺接种待检菌于2支HL培养基，其中1支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35℃培养箱中培养48h或更长。观察现象，判断并解释结果。

（3）结果记录及分析。

分解葡萄糖则培养基变黄色，不分解葡萄糖不变色；2管均不变色（不产酸）为产碱型或不分解糖型；2管均变成黄色（产酸）为F型；仅不加石蜡管变黄（产酸），加过石蜡的不变色（不产酸）为O型。

记录实验现象，判断各菌对葡萄糖的代谢类型。

图1－11　氧化－发酵试验结果

3．甲基红试验。

甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸的，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，加入培养基中的甲基红指示剂由橘黄色（pH 6．3）变为红色（pH 4．2），即甲基红反应呈阳性。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、痢疾志贺菌、待检菌斜面各1支。

培养基：葡萄糖蛋白胨培养基试管3支。

（2）方法。

无菌接种细菌，35℃培养箱中培养2d后，葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，观察现象，判断并解释结果。

（3）结果记录及分析。

培养基变为红色者为阳性，不变色为阴性。

甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性反应。

记录实验现象，判断各菌的检测结果。

图1－12　甲基红试验结果

4．V－P试验。

某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即V－P反应是阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。有时为了使反应更为明显，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、痢疾志贺菌、待检菌斜面各1支。

培养基：葡萄糖蛋白胨培养基试管3支。

（2）方法。

无菌接种细菌培养2d后，将另1支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入5～10滴40%KOH，然后加入1滴的5%α－萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃培养箱中培养15～30min，以加快反应速度。

（3）结果记录及分析。

培养基变为红色者为阳性，不变色为阴性。

记录实验现象，判断各菌的检测结果。

图1－13　V－P试验结果

（二）氨基酸的代谢

1．吲哚试验。

有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、痢疾志贺菌、待检菌斜面各1支。

培养基：蛋白胨培养基试管3支。

（2）方法。

无菌接种细菌，培养2d后的蛋白胨水培养基内加3～4滴乙醚，摇动数次，静置1～3min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。

（3）结果记录及分析。

在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应；没有红色环的为阴性。

记录实验现象，判断各菌的检测结果。

图1－14　吲哚试验结果

2．氨基酸脱羧酶试验。

具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸生成胺（如：鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺，赖胺酸→尸胺）和CO₂，培养基变碱，指示剂变色（溴甲酚紫由黄变紫，溴麝香草酚蓝由绿变蓝）。而对照管不含氨基酸，分解葡萄糖产酸使培养基变黄色。

（1）材料。

菌种：变形杆菌、产气肠杆菌、待检菌各1支。

培养基：氨基酸培养基、对照培养基。

（2）方法。

将菌种分别接种于鸟氨酸培养基和对照培养基中，并加入无菌液体石蜡，37℃培养箱中培养18～24h观察结果。

（3）结果记录及分析。

观察测定管和对照管的颜色变化，如表1－8所示。判断氨基酸脱羧酶的试验结果，如图1－15所示。

表1－8　氨基酸脱羧酶的结果判断标准

图1－15　氨基酸脱羧酶试验结果

3．苯丙氨酸脱氨酶实验。

某些细菌可在产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入FeCl₃后产生绿色反应。

（1）材料。

菌种：变形杆菌、产气肠杆菌、待检菌各1支。

培养基：苯丙氨酸培养基。

（2）方法。

将菌分别接种至苯丙氨酸培养基，37℃培养箱中培养18～24h，滴加10% FeCl₃1～2滴。

（3）结果记录及分析。

观察结果前沿着管壁缓慢加入2～3滴FeCl₃溶液，立即出现绿色者为阳性。（应立即观察结果，延长反应时间会引起褪色。）如图1－16所示。

图1－16　苯丙氨酸脱氨酶试验结果

记录实验现象，判断各菌的检测结果。

4．硫化氢试验。

硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、痢疾杆菌、待检菌斜面各1支。

培养基：醋酸铅培养基试管3支。

（2）方法。

无菌穿刺接种细菌，置37℃培养箱中培养48h，观察结果。

（3）结果记录及分析。

有黑色硫化铅的产生为阳性，无黑色产生为阴性。

记录实验现象，判断各菌的检测结果如图1－17所示。

图1－17　硫化氢试验结果

（三）其他物质的代谢

1．柠檬酸盐实验。

有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠埃希菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6．0时呈黄色，pH在6．0～7．0时为绿色，pH大于7．6时呈蓝色。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、产气肠杆菌、待检菌斜面各1支。

培养基：柠檬酸盐斜面培养基试管3支。

（2）方法。

无菌接种细菌，培养48h，观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。

（3）结果记录及分析。

斜面培养基上有细菌生长，培养基蓝色为阳性；有细菌生长，培养基绿色为阴性。

记录实验现象，判断各菌的检测结果如图1－18所示。

图1－18　枸橼酸盐利用试验结果

2．硝酸盐还原实验。

某些细菌能还原培养基中的硝酸盐生成亚硝酸盐、氨和氮等。亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，后者与α－萘酚结合为红色的N－α－萘胺偶氮苯磺酸。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、产气肠杆菌、待检菌斜面各1支。

培养基：硝酸盐培养基试管3支。

（2）方法。

将菌接种至硝酸盐培养基，培养1～4d，每天吸取培养液0．5～1mL，加入硝酸盐还原剂（甲液和乙液等量混合）0．1mL观察结果。

（3）结果记录及分析。

立刻或于10min内呈红色者为阳性，不变色者阴性。

记录实验现象，判断各菌的检测结果如图1－19所示。

图1－19　硝酸盐还原试验结果

3．明胶水解试验。

微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源外，当缺乏糖类物质时，亦可用它们作为碳源和能源。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在。而在25℃以上明胶就会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、待检菌斜面各1支。

培养基：明胶培养基试管3支。

（2）方法。

用接种针分别穿刺接种待检菌，37℃培养箱中培养1d后置4℃冰箱中。观察明胶液化情况。

（3）结果记录及分析。

上层培养基液化（典型的为漏斗状）的为阳性；没有液体产生的为阴性。

记录实验现象，判断各菌的检测结果如图1－20所示。

图1－20　明胶液化示意图

（四）酶的检测

1．氧化酶试验。

氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成红色或蓝色的醌类化合物。主要用于肠杆菌科细菌和假单胞菌的鉴别，前者为阳性，后者为阴性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。

某些细菌（如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌等）具有氧化酶，能将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成紫红色的醌类化合物。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、待检菌各1支。

试剂：氧化酶试剂。

（2）方法。

用滤纸条蘸取被检菌落，用滴管吸取氧化酶试剂，滴加于滤纸条菌落上。

（3）结果记录及分析。

阳性者立即出现红色或蓝色，继而逐渐加深；阴性不变色。

记录各菌氧化酶试验结果。

2．触酶（过氧化氢酶）试验。

某些细菌具有过氧化氢酶，能分解过氧化氢产生水，并释放出初生态氧，生成氧分子而出现气泡。

（1）材料。

菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、待检菌各1支。

（2）方法。

无菌挑取固体培养基上的待检菌落，置于洁净玻片上，滴加3%过氧化氢溶液数滴，立刻观察有无气泡产生。注意挑取血培养基上的菌落时不要碰到血培养基。

（3）结果记录及分析。

于10s内有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

记录各菌的触酶试验结果。

3．脲酶实验。

具有脲酶的细菌分解尿素产氨，使整个培养基变碱呈红色。

（1）材料。

菌种：普通变形杆菌、金黄葡萄球菌、待检菌斜面各1支。

培养基：尿素培养基斜面3支。

（2）方法。

无菌接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌，置35℃恒温下，培养箱中培养24～48h。观察培养基颜色变化。

（3）结果记录及分析。

培养基红色，脲酶实验阳性；培养基不变色，脲酶实验阴性。

记录实验现象，判断各菌的检测结果如图1－21所示。

图1－21　尿素酶试验结果

（五）复合试验

1．KIA（克氏双糖铁高层斜面）。

克氏双糖铁（KIA）斜面培养基，用酚红作指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色，培养基中葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1/10，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，分解葡萄糖产酸使pH值降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物中和，使斜面部分又变成红色；底层由于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所产生的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。若细菌分解葡萄糖、乳糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细菌分解氨基酸产生H2S，则与硫化亚铁作用生成黑色的硫化铁，使培养基变黑。

（1）材料。

菌种：大肠埃希菌、伤寒沙门菌、待检菌各1支。

试剂：KIA斜面。

（2）方法。

接种针无菌挑取少量待检菌，先在KIA培养基底层穿刺，距管底3～5mm为止；然后上提接种针，从斜面底部向上划一条直线，然后由斜面底部向上做蜿蜒划线。

37℃培养箱中培养18～24h。

（3）结果记录及分析。

结果分析：

①斜面、底层均呈黄色且有气泡，说明发酵葡萄糖和乳糖产酸产气，记为：A/A产气；

②斜面红色、底层黄色，说明该菌只发酵葡萄糖不发酵乳糖，记为：K/A；

③培养基变黑，说明该菌能产生H₂S，记为：H₂S（＋）。

记录各菌的KIA试验结果如图1－22所示。