微生物的生理生化反应

微生物的生理生化反应_现代微生物学实验

实验八　微生物的生理生化反应

不同微生物对不同有机化合物的分解利用情况各不相同。有些微生物能分泌淀粉酶将淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖；有些微生物可分泌脂肪酶，将脂肪水解为甘油和脂肪酸。葡萄糖进入细胞后，不同微生物经不同途径发酵葡萄糖，产生不同的代谢产物。微生物对碳、氮化合物的分解利用的生理生化反应也是微生物菌种鉴定的重要依据之一。

一、大分子物质的水解实验

（一）实验目的

（1）通过实验证明不同微生物对各种有机大分子的不同水解能力。

（2）掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。

（二）实验原理

微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解后才能够利用。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程可通过观察微生物菌落周围的物质变化来证实，如淀粉遇碘液会变蓝色，如果微生物可以分泌淀粉酶，就可以将菌落周围的淀粉水解，用碘测定时就不会产生蓝色。脂肪被脂肪酶水解后可产生脂肪酸，导致培养基的pH降低，在培养基中加入中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色。

微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源，当糖类物质缺乏时，亦可以用它们作为碳源和能源。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固态形式存在，而在25℃以上就会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，可以使明胶水解，产生液化现象。

有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，可用石蕊牛奶来检测。石蕊培养基由脱脂牛奶和石蕊组成，是浑浊的蓝色。酪素水解成氨基酸和肽后，培养基就会变得透明。石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵，因为在酸的存在下，石蕊会转变成粉红色，而过量的酸可引起牛奶的固化（凝乳形成）。氨基酸的分解会引起碱性反应，使石蕊变成紫色。此外，某些细菌能还原石蕊，使试管底部变为白色。

（三）实验器材

1．菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。

2．培养基

（1）淀粉水解培养基

蛋白胨10g，牛肉膏3g，可溶性淀粉2g，NaCl 5g，琼脂15～20g，水1 000mL，pH 7．4～7．8，121℃高压蒸汽灭菌30min。

（2）油脂培养基

蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，香油或花生油10g，中性红（1．6%水溶液）1mL，琼脂15～20g，蒸馏水1 000mL，pH 7．2。

注意：不能使用已变质的油；油和琼脂及水先加热；调好pH之后，再加入中性红使培养基稍呈红色为止；分装培养基时，需不断地搅拌，使油脂均匀分布于培养基中。

（3）明胶培养基

蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，明胶120g，蒸馏水1 000mL，pH 7．2～7．4。

（4）石蕊牛奶培养基

①脱脂牛奶的制备：新鲜牛奶用离心机分离，除去上层奶油，取下层脱脂牛奶。若无新鲜牛奶可用脱脂奶粉代替，每1 000mL水溶解100g脱脂奶粉，或将鲜奶煮沸，在冷凉处静置24h，用虹吸法取出底层牛奶。

②石蕊液的制备：将石蕊浸色，即在蒸馏水中过夜或更长时间，使石蕊变软而易于溶解，溶解后过滤，即可用作配制石蕊牛奶。石蕊2．9g，蒸馏水100mL。

③石蕊牛奶的配制：2．5%石蕊水溶液4mL，脂肪牛奶100mL，混合后的颜色为丁香花紫色为适度，分装试管，牛奶高度约4cm。间歇灭菌或以115℃蒸汽灭菌20～30min。

注意事项：最好用新鲜牛奶，否则需调pH，调过pH的牛奶色调不正。

3．溶液或试剂

卢戈氏碘液。

4．仪器或其他用具

无菌平板、无菌试管、接种针、接种环、试管架等。

（四）实验步骤

1．淀粉水解试验

（1）将装有淀粉培养基的三角瓶置于沸水浴中融化，然后取出冷却至约50℃，无菌操作制成平板。

（2）用记号笔在平板底部划成四部分。

（3）将以上菌种分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别写上菌名。

（4）将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养24h。

（5）结果观察：打开皿盖滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解，为阳性。根据透明圈的大小可以初步判断该菌水解淀粉能力的强弱。

图8－1　淀粉的水解作用

1．待测菌　2．透明区　3．蓝色区

2．油脂水解试验

（1）将装有油脂培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振荡使油脂分布均匀，再倾入培养皿中，待凝固后，做成平板。

（2）用记号笔在平板底部划成四部分，分别标上菌名。

（3）将上述菌种分别用无菌操作划十字接种于平板的相对应部分的中心。

（4）将平板倒置于37℃恒温箱中培养24h。

（5）取出平板，观察菌苔颜色，如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。

3．明胶液化试验

（1）取3支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。

（2）用接种针分别穿刺接种。

（3）将接种后的试管置于20℃恒温箱中培养2～5d。

（4）观察明胶液化情况。

4．石蕊牛奶试验

（1）取2支石蕊牛奶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。

（2）分别接种待试菌种。

（3）将接种后的试管置于37℃恒温箱中培养24～48h。

（4）观察培养基颜色变化。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，而被还原时为白色。

（五）实验记录

二、糖发酵试验

（一）实验目的

（1）了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。

（2）掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。

（二）实验原理

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类，当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH 6．8）变为黄色（pH 5．2）；气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

（三）实验器材

1．菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）。

2．培养基

葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）。

糖发酵培养基：蛋白胨10g，葡萄糖（乳糖）10g，NaCl 5g，蒸馏水1 000mL。调pH 7．4后，每1 000mL培养基中加入1．6%溴甲酚紫（BCP）1mL，混匀，培养基呈蓝色。常规灭菌。

3．仪器或其他用具

试管架、接种环等。

（四）实验步骤

（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。

（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支，一支接入大肠杆菌，一支接入普通变形杆菌，第三支不接种作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌和不接种作为对照。在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管有气泡进入。

（3）将接种过和作为对照的6支试管均置37℃培养24～48h。

（4）观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡产生。

图8－2　糖发酵（杜氏发酵管）

A．发酵前　B．发酵后（产气）

（五）实验记录

将结果填入下表，“＋”表示产酸或产气，“－”表示不产酸或不产气。

（六）思考题

（1）简述淀粉水解试验、油脂水解试验和石蕊牛奶试验的基本原理。

（2）细菌利用糖类的过程中，产生的酸性物质和气体可能是什么？

参考文献

［1］程丽娟，薛宝泉．微生物学实验技术［M］．2版．北京：科学出版社，2012．

［2］周德庆．微生物学实验教程［M］．2版．北京：高等教育出版社，2006．