细胞组分的化学反应

实验四　细胞组分的化学反应

构成细胞的化学成分包括蛋白质、核酸、酶、糖类、脂类等有机化合物以及水、无机盐等无机化合物。细胞中不同的生物大分子由于组成成分和分子结构的不同，使得它们具有不同的化学性质。人们根据这些化合物的性质和特点，设计了许多特异性的化学反应，这就是细胞化学方法。

细胞化学方法是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的化学成分进行定性、定位、定量研究。

一、实验目的

（1）掌握常用的原位显示细胞内几种化学成分的一般方法。

（2）熟悉细胞内DNA和RNA、酸性蛋白、碱性蛋白、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶及过氢化物酶等成分的一般分布。

（3）了解细胞化学实验的基本原理。

二、实验原理

核酸是细胞中的一类重要的生物大分子，按其化学组成、分子结构的差异，可分为DNA和RNA两种类型。核酸呈酸性，故可与碱性染料发生亲和反应而显色。由于DNA和RNA分子聚合程度不同，它们分别对不同的碱性染料具有亲和力，从而显示出两种核酸分子在细胞中的分布。

蛋白质由于所带的碱性基团（如氨基）和酸性基团（如羧基）的数目或比例不同，因此它们在生理条件下有的呈现碱性，有的则呈酸性。含碱性基团多（带正电荷）的蛋白质为碱性蛋白，含酸性基团多（带负电荷）的蛋白质为酸性蛋白。根据这两类蛋白的差异，便可利用碱性染料和酸性染料分别对细胞进行染色，将碱性蛋白和酸性蛋白分别显示出来。

在细胞化学领域，利用酶促反应产物本身的颜色或与某些试剂作用后出现的特殊颜色反应，可以将相应的酶在细胞中的分布间接地显示出来。

三、实验用品

（1）材料：蟾蜍、小鼠、洋葱鳞茎、马铃薯、花生、培养的HeLa细胞。

（2）器材和仪器：光学显微镜、解剖器材、解剖盘、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸、染色缸、恒温水浴箱、注射器等。

（3）试剂：PBS缓冲液（pH　7.2）、Carnoy固定液、甲基绿－哌洛宁混合染液、纯丙酮、丙酮、二甲苯、中性树胶、Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）、亚硫酸水溶液（漂白液）、4.5%醋酸、10%中性甲醛（福尔马林）、5%三氯醋酸、0.1%碱性固绿、0.1%酸性固绿、0.1%钼酸胺、0.85%NaCl、1%联苯胺液、0.5%硫酸铜、1%番红、过碘酸乙醇溶液、无水乙醇、70%乙醇、95%乙醇、1mol/L盐酸、革兰碘液、苏丹Ⅲ溶液。

四、实验内容

（一）细胞内DNA和RNA的显示

1.Brachet反应显示细胞内的DNA和RNA

利用DNA和RNA的聚合程度不同，对碱性染料有不同的亲和力而进行选择性染色。细胞经甲基绿－哌洛宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应。一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料哌洛宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿上有两个相对的正电荷，它对聚合程度高的DNA有强的亲和力，DNA被染成蓝色和绿色；而派洛宁分子上只有一个相对的正电荷，它仅和聚合程度低的RNA相结合，使RNA染成红色（解聚的DNA也能和派洛宁结合呈红色）。由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性和定量分析。

【方法一】　培养细胞DNA、RNA的显示

（1）接种HeLa细胞于盖片上并培养24～48h，使其长成单层。

（2）取出盖片，用PBS（pH　7.2）轻轻冲洗盖片表面去除残渣。

（3）放入Carnoy固定液中固定1h。

（4）浸入甲基绿－哌洛宁醋酸缓冲液中染色30min。

（5）取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗2～3次（2～3s），吸去水分。放入纯丙酮中分化2～3s。

（6）放入1/2丙酮＋1/2二甲苯中5s。

（7）放入纯二甲苯中透明5min。

（8）滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片。

（9）观察：光镜下可见细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，其中核仁被染成紫红色。

【方法二】　洋葱表皮细胞DNA、RNA的显示

（1）撕取洋葱表皮一小片，置于载玻片上。

（2）加一滴甲基绿－哌洛宁染液，染色10～30min。

（3）用蒸馏水一滴略洗一下，然后以滤纸吸干玻片上水分。

（4）盖上盖片，镜检可见细胞质和核仁中的RNA被染成红色，核质中的DNA染成绿色。

【方法三】　蟾蜍血涂片DNA、RNA的显示

（1）用破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放入解剖盘中，剪开胸腔，小心将心脏剪一小口，取心脏血制作一张血涂片，室温晾干。

（2）固定：将晾干的血涂片浸入70%乙醇中，固定5～10min，室温晾干。

（3）染色：在标本上滴数滴染液染色5～10min，用蒸馏水冲洗，吸去多余的水分。

（4）分化：将血涂片在纯丙酮中蘸一下进行分化，取出晾干。

（5）观察：光镜下可见细胞核中的DNA染成绿色，细胞质中的RNA染成淡红色。

2.Feulgen反应原位显示细胞内的DNA和RNA

（1）原理：Feulgen反应是测定DNA在细胞中分布的经典方法。原理是盐酸水解组织中的DNA，打开DNA的嘌呤－脱氧核糖键而释放出醛基，Schiff试剂中的无色亚硫酸品红与自由醛基反应，产生紫红色的醌基化合物。凡有DNA的部位就呈现出该阳性反应，而细胞中其他物质不着色。

（2）方法

1）将洋葱根尖或鳞茎表皮放在60℃1mol/L HCl中，水解8～10min，蒸馏水洗。

2）放入Schiff试剂中避光染色30min。

3）在新配制的亚硫酸水溶液（漂白液）中洗3次，每次5min，至出现红色。

4）水洗5min。

5）加一滴4.5%醋酸在载玻片上，将根尖放上，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省略这一步）。

6）镜检：细胞核呈紫红色。

（3）对照实验

1）将洋葱根尖放在5%的三氯醋酸中90℃水浴抽提15min。然后按上述1～6步骤制片观察。

2）洋葱根尖不经1mol/L HCl 60℃水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按上述2～6步骤制片观察。对照片由于DNA被三氯醋酸提取破坏或不经水解，故无紫红色反应。

（二）细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示

由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。

【方法一】

（1）用镊子撕取洋葱鳞茎表皮两片，放入10%中性甲醛中固定15min，然后用蒸馏水冲洗数次。

（2）将材料转入5%三氯醋酸中，置90℃恒温水浴15min，抽提DNA和RNA。

（3）用蒸馏水洗数次，除去三氯醋酸，将材料展平于载玻片上，其中一片滴加几滴0.1%酸性固绿液，另一片滴加几滴0.1%碱性固绿液，分别染色5～10min，除去染液，加上盖玻片。

（4）镜检：光镜下可见被染成绿色的酸性蛋白主要分布在细胞质和核仁，被染成绿色的碱性蛋白主要分布在细胞核中的染色质。

【方法二】

（1）制备蟾蜍心脏血血涂片2张，室温晾干。

（2）将涂片做好标记放在70%乙醇中固定5min，室温晾干。

（3）放入5%三氯醋酸中60℃恒温水浴30min，抽提出核酸。

（4）清水冲洗多次（3min以上），以除去片上残留的三氯醋酸（这是染色成功的关键）。

（5）用滤纸吸干玻片上水分。

（6）一张玻片放入0.1%碱性固绿（pH 8.0～8.5）中染色10～15min，另一张玻片放入0.1%酸性固绿（pH 2.0～2.5）染色5～10min。

（7）清水冲洗，盖上盖片镜检。经碱性固绿染色的标本，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，为碱性蛋白质存在处。经酸性固绿染色的标本，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。

（三）细胞内过氧化物酶的显示

生物体内的细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢，存在于动、植物组织中的过氧化氢酶，能使过氧化氢分解，生成水放出氧气，对机体起保护作用；过氧化氢酶系还能把许多胺类物质氧化为有色化合物，若用联苯胺混合液处理标本，细胞内的过氧化氢酶能把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物（蓝色为中间产物——联苯胺蓝不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙）。可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。

【方法一】　马铃薯过氧化氢酶的显示

徒手切片，取一薄片置于载玻片上，滴加新配制的2%过氧化氢溶液，可见组织周围立即放出大量气泡，提示植物活组织中有过氧化氢酶存在。

对照：将上述组织放入100℃水浴1min，重复上述实验，观察其结果是否一致。

【方法二】　洋葱根尖细胞过氧化氢酶的显示

（1）取洋葱根尖徒手切一薄片，浸在溶有0.1%钼酸胺的0.85%NaCl溶液中5min。

（2）转入1%联苯胺溶液中约2min，至切片出现蓝色为止。

（3）以0.85%NaCl溶液冲洗。

（4）将切片置于载玻片上，盖上盖玻片。

（5）光镜下观察可见过氧化氢酶存在处有蓝色沉淀。

【方法三】　小鼠骨髓细胞过氧化氢酶的显示

（1）取小鼠一只，以颈椎脱臼法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。

（2）推片，室温晾干。

（3）将涂片放入0.5%硫酸铜中浸30～60s。

（4）取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6min。

（5）清水冲洗，放入1%番红溶液中复染2min。清水冲洗，室温晾干。

（6）镜检或封片后镜检：涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒，即为过氧化氢酶所在位置。

（四）细胞内多糖的观察——过碘酸雪夫试剂反应

过碘雪夫反应（periodic acid Schiff reaction，PAS反应）是利用过碘酸作为强氧化剂测定细胞中的多糖。打开多糖中的C—C键，使多糖分子中的己二醇结构（CH₂OH—CH₂OH）变为己二醛结构（CHO—CHO），后者与Schiff试剂反应呈紫红色。

【方法一】

（1）徒手切取马铃薯块茎薄片，浸入过碘酸溶液中5～15min。

（2）70%乙醇冲洗，除去残留的过碘酸。

（3）Schiff溶液中染15～20min。

（4）亚硫酸溶液中洗涤3次。

（5）蒸馏水洗涤，装片镜检。多糖部位呈紫红色。

对照：材料不经过碘酸氧化，其他方法同上，结果呈阴性反应。

【方法二】

（1）徒手切取马铃薯块茎薄片放在载玻片上。

（2）滴一革兰碘液，可见标本立即被染成蓝色。

（3）盖上盖玻片，低倍镜下检查，可见多角形的薄壁细胞中，有许多椭圆形蓝色颗粒，即淀粉粒。

（五）细胞内脂肪的观察

脂肪是生物体内重要的贮藏能量的物质，苏丹Ⅲ与脂类物质有较大的亲和力，溶于脂肪细胞的脂滴中，使之染成金黄色。

方法：将花生种子切一薄片，放于载片上，加苏丹Ⅲ溶液一滴，盖上盖玻片，置低倍镜下观察，可见种子内有许多金黄色泡状颗粒，即为脂肪滴。

五、注意事项

注意严格按实验要求做好每一步，尤其染色时间要足够，冲洗要彻底。

六、作业与思考题

（1）用彩色笔绘出Brachet反应及PAS反应的镜下所见。

（2）简单叙述过氧化氢酶、DNA、RNA和多糖等显示方法的原理。