细菌的生物化学试验

（一）糖的代谢

1．糖（醇、苷）类发酵试验 ①原理：各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，分解糖类的能力各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，可利用此特点以鉴别细菌。②培养基：培养基中加入0．5%～1%的糖类、醇类、苷类，可分为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。③方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中，于培养箱中培养数小时至两周，观察结果。④结果：若能分解糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应；若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象；若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。⑤应用：鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。

2．氧化－发酵试验（O／F试验） ①原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；可以进行无氧降解的，称为发酵型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖，发酵型细菌在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。②方法：待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支加无菌液状石蜡，高度不少于1cm，于35℃培养48h或更长。③结果：均无变化为产碱型或不分解糖型；均产酸为发酵型；仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。④应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。

3．β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验） ①原理：有的细菌可产生β－半乳糖苷酶，分解邻－硝基酚－β－D－半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻－硝基酚，在很低浓度下也可检出；②方法：克氏双糖铁培养基上取菌，在0．25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加一滴甲苯并充分振摇，使酶释放，37℃水浴5min，加入0．25ml ONPG试剂，水浴20min至3h观察结果；③结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min显色；④应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌为阳性，不发酵乳糖的细菌为阴性。主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。

4．七叶苷水解试验 ①原理：某些细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的Fe2＋反应，使培养基变黑；②方法：待检菌接种于七叶苷培养基中，置35℃温育过夜；③结果：培养基变黑色为阳性，不变色为阴性；④应用：用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。

5．甲基红实验 ①原理：细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解产生甲酸、乙酸、乳酸等，使pH降至4．5以下，加入甲基红试剂呈红色，为阳性。若分解葡萄糖产酸量少或产生的酸转化为其他物质，培养基pH在6．2以上，加入指示剂后呈黄色，为阴性。②方法：待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养2～4d，在培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。③结果：红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。④应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性。

6．V－P试验 ①原理：细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中，可被空气中的氧氧化为二乙酰，与培养基中精氨酸的胍基作用生成红色化合物，为阳性；②方法：待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，35℃培养48h后加入甲液（6%α－萘酚酒精溶液）和乙液（40% KOH溶液），振摇；③结果：数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且35℃4h后仍如故者为阴性；④应用：常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。

（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验

1．吲哚（靛基质）试验 ①原理：某些细菌具有色氨酸酶，分解色氨酸生成吲哚（靛基质），加入对位二甲氨基苯甲醛后形成红色的玫瑰吲哚；②方法：待检菌接种于蛋白胨水培养基中，35℃培养24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂；③结果：两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性；④应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。大肠埃希菌、变形杆菌阳性，志贺菌、沙门菌阴性。

2．明胶液化试验 ①原理：某些细菌可产生一种胞外酶，使明胶分解为氨基酸，失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体；②方法：被检菌穿刺接种于明胶培养基，22℃培养7d，每日观察结果；③结果：培养基呈液化状态为阳性；④应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌、沙雷菌等可液化明胶。某些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶，多数假单胞菌也能液化明胶。

3．硫化氢试验 ①原理：某些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子形成黑褐色的沉淀；②方法：待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，35℃培养24～48h观察结果；③结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性；④应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性。但沙门菌属中也有阴性菌种。

4．尿素分解试验 ①原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性；②方法：将检菌接种于尿素培养基，35℃培养18～24h，观察结果；③结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性；④应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。变形杆菌属、肺炎克雷伯菌属、摩根菌属、普罗威登斯菌属、幽门螺杆菌和结肠耶尔森菌为阳性。而斯氏和产碱普罗威登斯菌阴性。

5．苯丙氨酸脱氨酶试验 ①原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸形成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色；②方法：被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35℃培养18～24h，加10%三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下；③结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，反应时间过长会褪色；④应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。

6．氨基酸脱羧酶试验 ①原理：某些细菌具有氨基酸脱羧酶，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱。②方法：被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液状石蜡，35℃培养1～4d，每日观察结果。③结果：对照管呈黄色，测定管呈紫色为阳性；测定管呈黄色为阴性；对照管呈现紫色则试验无意义。④应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。宋内和鲍氏志贺菌为阳性，其他志贺菌均为阴性。

（三）碳源和氮源利用试验

1．枸橼酸盐利用试验 ①原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，利用枸橼酸盐作为唯一碳源，在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱性。②方法：被检菌接种于枸橼酸盐培养基，35℃培养1～4d，每日观察结果。③结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐的细菌则不能生长，培养基不变色，为阴性。④应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定，埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属常为阳性。

2．丙二酸盐利用试验 ①原理：某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生成碳酸钠，使培养基变碱；②方法：被检菌接种于丙二酸盐培养基，35℃培养24～48h后观察结果；③结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性；④应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别，克雷伯菌属为阳性，肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。

（四）酶类试验

1．氧化酶试验 ①原理：有氧化酶（细胞色素氧化酶）的细菌，可使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物；②试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺；③方法：分为菌落法、滤纸法和试剂纸片法；④结果：细菌与试剂接触10s内呈深紫色，为阳性，同时以铜绿假单胞菌作为阳性对照，大肠埃希菌作为阴性对照；⑤应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。

2．过氧化氢酶试验（触酶试验） ①原理：具有过氧化氢酶的细菌，使H2O2生成水和氧，出现气泡。②方法：取菌置于洁净玻片上，加3%过氧化氢数滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察。③结果：大量气泡产生者为阳性，不产气泡为阴性。④应用：用于革兰阳性球菌初步分群，葡萄球菌和微球菌为阳性，链球菌属为阴性。

3．硝酸盐还原试验 ①原理：某些细菌可还原硝酸盐为亚硝酸盐，再与乙酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸和α－萘胺作用，生成红色的N－α－萘胺偶氮苯磺酸。②方法：被检菌接种于硝酸盐培养基，35℃培养1～4d，将甲液（对氨基苯磺酸0．8g＋5mol／L醋酸100ml）、乙液（α－萘胺0．5g＋5mol／L醋酸100ml）等量混合后（约0．1ml）加入培养基内，立即观察。③结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，一是硝酸盐没有被还原，试验阴性；二是硝酸盐被还原为其他产物导致假阴性，在试管内加入少许锌粉，出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。培养基管内的小倒管如有气泡产生，表示有氮气生成。④应用：肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。

4．脂酶试验 ①原理：有的细菌产生脂酶，分解脂肪成游离的脂肪酸，使培养基中与脂肪结合的维多利亚蓝释放出来，呈深蓝色；②方法：将被检菌接种于脂酶培养基（含维多利亚蓝）中，于37℃培养24h；③结果：培养基变为蓝色为阳性，阴性为粉红色或无色；④应用：用于厌氧菌的鉴别。类杆菌属中的中间类杆菌产生脂酶，其他为阴性；芽胞梭菌属中产芽胞梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也有此酶，其他梭菌阴性。

5．卵磷脂酶试验 ①原理：有的细菌产生卵磷脂酶，可分解卵磷脂，生成甘油酯和水溶性磷酸胆碱；②方法：将被检菌划线接种或点种于1%卵黄琼脂平板上，于35℃培养3～6h；③结果：3h后在菌落周围形成乳白色浑浊环，为阳性；④应用：用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭菌为阳性，其他梭菌为阴性。

6．DNA酶试验 ①原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解成寡核苷酸链。在菌落平板上加入酸后，会在菌落周围出现透明环。②方法：被检菌点种于0．2%DNA琼脂平板上，35℃培养18～24h，用1mol／L盐酸覆盖平板，观察结果。③结果：菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。④应用：在肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶，革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶。

7．凝固酶试验 ①原理：致病性葡萄球菌可产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变成纤维蛋白，附着于细菌表面发生凝集。玻片法检测结合凝固酶，试管法检测游离凝固酶。②方法：有玻片法和试管法，玻片法是取兔血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的玻片上，挑取被检菌分别混合；试管法是取试管2支，各加0．5ml人或兔血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分别加入血浆中混匀，37℃水浴3～4h。③结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固判为阳性。④应用：鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，金黄色葡萄球菌和中间葡萄球菌为阳性。

8．CAMP试验 ①原理：B群链球菌能产生CAMP因子，促进葡萄球菌的β－溶血素活性，因此在两菌的交界处溶血力增加，出现箭头样溶血区。②方法：以金黄色葡萄球菌划一横线接种于血琼脂平板上，将被检菌与前一划线做垂直划线接种，两线不能相交，相距0．5～1cm，37℃培养18～24h，观察结果。每次试验都设阴性和阳性对照。③结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。④应用：在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，可作为特异性鉴定。

9．胆汁溶菌试验 ①原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌；②试剂：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁；③方法：分为平板法和试管法；④结果：平板法以“菌落消失”判为阳性；试管法以“加胆盐的培养物变透明，而对照管仍浑浊”判为阳性；⑤应用：用于肺炎链球菌与甲型链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。

（五）抑菌试验

1．O129抑菌试验 ①原理：O129对弧菌属细菌有抑制作用，对产气单胞菌属细菌无抑制作用；②方法：待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取O129纸片贴于平板上，35℃培养18～24h观察结果；③结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药；④应用：用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对O129敏感，产气单胞菌属耐药。

2．杆菌肽试验 ①原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，其他群链球菌绝大多数耐药；②方法：待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布于血液琼脂平板上，稍干后贴上0．04U／片的杆菌肽纸片，35℃培养18～24h，观察结果；③结果：抑菌环直径＞10mm为敏感，抑菌环直径＜10mm为耐药；④应用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。

3．奥普托欣（Optochin）试验 ①原理：几乎所有肺炎链球菌对Optochin敏感，对其他链球菌则无作用；②方法：待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴上含5pg／片的Optochin纸片，35℃培养18～24h，观察结果；③结果：抑菌环直径＞14mm，为敏感，抑菌环直径≤14mm，应再做胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌；④应用：用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。