带有内部对照的鼠疫菌检验试剂盒

第二节　带有内部对照的鼠疫菌PCR检验试剂盒

聚合酶链式反应（PCR）用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段，在这一反应中，使用了两段寡核苷酸作为反应的引物。一般这两引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，位于待扩增DNA区段的两侧。反应时首先在摩尔数大大过量的两段寡核苷酸及4种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性。然后将反应混合液冷却至某一温度，使引物退火，在DNA聚合酶作用下与模板DNA结合得以延伸。如此反复进行变性、退火和延伸，靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长。随着分子生物学的发展，多聚酶链反应（PCR）已得到了广泛的应用，尤其对于致病微生物的检测有着重要的作用。但是，PCR方法也有它的不足之处，由于交叉污染或者非特异性扩增，以及反应抑制剂等多种原因，总会出现假阳性或假阴性的结果。一旦发生了假阴性结果，对于鼠疫这类烈性传染病其后果是极其严重的。为了避免假阴性的发生，需对PCR方法设计内部对照，即人工合成一DNA模板，以相同的引物与鼠疫菌DNA模板同时进行PCR扩增。但是，作为内部对照的质粒模板，其浓度对于结果也有一定的影响。只有选取适宜的浓度，才能真正避免假阴性的发生。

带有内部对照的鼠疫多重PCR试剂盒所用引物序列如下：

F₁上游引物：5′－GGAACCACTAGCACATCTGTT－3′；

下游引物：5′－ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC－3′。

Pla上游引物：5′－ACTACGACTGGATGAATGAAAATC－3′；

　 下游引物：5′－GTGACATAATATCCAGCGTTAATT－3′。

Inv上游引物：5′－TCGCGTGATTTCTCCGACTA－3′；

　下游引物：5′－CCAGGCGATAGTTCATTTGGA－3′。

1－1上游引物：5′－GAAGTACTCCTCCAACAGAG－3′；

　　下游引物：5′－CACGGAGTATGTGATGGTTC－3′。

内部对照构建示意图

不同浓度鼠疫菌模板与内部对照扩增结果

这些基因区域都是鼠疫菌所特有的，可以和其他肠道菌相鉴别。F₁抗原是一种糖蛋白，是鼠疫菌的特异性抗原之一，鼠疫菌的大质粒与F₁抗原的合成有关。在37℃培养时产生较多，而在28℃培养时产生较少。F₁抗原被认为是保护性抗原之一，具有抗吞噬能力。但和VW抗原的抗吞噬机制不同。前者表现在不易被吞噬细胞吞噬，而后者则表现在被吞噬之后仍可在吞噬细胞内存活、繁殖并从吞噬细胞中释放出来。Pla（凝固酶和胞浆素原活化因子）两种活性属于同一多肽，这两种活性的表达受作用时温度的控制，但与细菌生长的温度无关。28℃时，显示高度的凝固酶活性，而在37℃时，则主要显示纤溶活性。凝固酶活性主要在蚤体内形成菌栓时起作用，而纤溶活性则在37℃宿主体内起作用。Inv基因位于鼠疫菌染色体上，其中存在IS1541插入，因而丧失了对上皮细胞的侵袭力，不再经消化道感染；而假结核菌没有这一插入，仍保留着对肠道的侵袭力。1－1基因位于鼠疫菌染色体上，为鼠疫所特有的序列，但其功能还不清楚。

我们的PCR试剂盒的反应体系为25μl，包括下列成分：

10×反应缓冲液　　　　　　　　　2．5μl

4×dNTP混合物（每种2．5mmol／L）2μl

引物（上游）　　　　　　　　　　1×4μl

引物（下游）　　　　　　　　　　1×4μl

内部对照模板　　　　　　　　　　1μl

待测模板　　　　　　　　　　　　1μl

双蒸去离子水　　　　　　　　　　9．5μl

Taq DNA聚合酶　　　　　　　　　 2～3U

反应条件：预变性95℃5min，1个循环，然后95℃1min，55℃1min，72℃1min。30个循环。最后72℃5min。

预期扩增片断大小：引物F₁：249bp，引物Pla：456bp，引物Inv：1000bp，引物1－1：1822bp，浓度为0．56μg／ml的内部对照模板的F₁扩增片断：645bp。

在检测标本时，需要以内部对照质粒与标本模板同时进行扩增。如果两者都扩增出来，认为标本为阳性；如果只有内部对照有扩增结果，标本为阴性；如果只有标本有扩增结果，那么为假阳性；如果两者都无扩增结果，那么此结果为假阴性。此外本法也可有效地将鼠疫菌与其他肠道致病菌如痢疾杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等相鉴别，而且本法操作较简便，将几对引物放在同一扩增体系中同时扩增，整个实验过程可在数小时内完成，是一种快速、特异、灵敏的检测病原体方法。缺点就是同时扩增时，由于竞争关系，四对引物可能不能全扩出结果，这时也可将它们分开来扩增。

在PCR反应体系中主要包括：模板DNA（25ng／μl），引物（25μmol／L），dNTP（10mmol／L／each），10×PCR buffer（free MgCl₂），MgCl₂（25mmol／L），Taq DNA聚合酶（4U／μl）和三蒸水。其中引物可以设计，由商家合成；dNTP，PCR buffer，MgCl₂，Taq DNA聚合酶从商家直接购买，这些都不需要特别处理，只要按使用说明书和要求条件使用即可。唯一需要处理的是模板DNA。我们在鼠疫的监测中主要的可见材料是啮齿动物及其寄生蚤。因此，模板的处理主要是对啮齿动物的脏器和寄生蚤进行处理。

多重PCR扩增结果

1．脏器　以无菌手续分别取动物的各种脏器（心、肝、脾、肺等）约1g，加入到1ml生理盐水或三蒸水的容器中，研碎，100℃水浴中煮沸10min，5000r／min离心5min（或采取密度梯度离心法），取上清直接用作PCR的模板。

2．蚤等昆虫　将经过鉴定的蚤放入乳钵中，用无菌生理盐水洗涤3次，研碎，加0．5ml无菌生理盐水，移入试管中，100℃水浴中煮沸10min，5000r／min离心5min（或采取密度梯度离心法），取上清直接用作PCR的模板。

3．注意事项

（1）整个模板的制备过程必须在强毒实验室内操作，按照所在实验室的要求，做好个人防护，防止实验室感染。

（2）所用的全部器皿和试剂必须消毒，确保无菌。

（3）在研碎的过程中，注意不要使脏器污染它处，不要使液体飞溅。

（4）在加热煮沸过程中，水量要没过脏器悬液量，禁止直接加热，防止液体外溢或烧焦。

（5）对制备好的模板暂时不用时，要放在－20℃保存。

（6）所有使用过的东西都必须用来苏儿浸泡消毒后，高压处理。

4．平行试验　在对啮齿动物的脏器和跳蚤进行PCR扩增的同时，目前还必须开展鼠疫细菌培养、反向血凝试验和免疫胶体金试验。对捕获的动物首先进行检蚤，然后进行解剖，取肝脏、脾脏、心脏、肺脏做细菌培养。使用敏感培养基，培养温度为28℃，同时做鼠疫噬菌体裂解试验。取肝脏、脾脏一小块约10g，加入含3%甲醛的无菌生理盐水溶液中，研磨碎后过夜。取上清做反向血凝试验。同时分别取上述各个脏器大约1g，加入1ml生理盐水，研碎后，10倍稀释3管，水浴煮沸10min，冷却离心取上清用作PCR的模板。对收集到的跳蚤，先鉴定蚤种，后用无菌生理盐水洗3次，研碎后，用白金耳钩取划线细菌培养。其余的加入生理盐水0．5ml制成悬液，水浴煮沸10min，冷却、离心取上清作为PCR的模板。

PCR的主要特点有：敏感性高，比鼠疫细菌学和反向间接血凝试验的阳性检出率高；特异性强，因设有内部对照，有效地防止了假阴性结果的发生；操作简便，整个过程都是仪器，只要把模板处理后加入即可；省时间，2h即可观察结果，可以用做鼠疫的一种快速诊断方法；危险性小，是把细菌煮沸杀死后进行PCR，不易感染到人，所需设备简单，只需一台PCR扩增仪和一台电泳仪。