脂肪组织工程

创伤、先天性异常和头颈、四肢的肿瘤切除等原因导致软组织缺乏而表现出轮廓塌陷。这种美容方面的缺陷严重影响了患者的情感感受。目前，恢复软组织容积和轮廓缺陷的标准方法是自体脂肪移植及脂肪单细胞悬液注射，分别通过术前手术直接切除和脂肪抽吸术获得。但自体脂肪移植存在矫枉过正、移植成活率低、移植物被吸收导致容积减少40%～60%而需要重复手术的缺陷。脂肪单细胞悬液注射创伤大（90%细胞受损）、异物反应、炎症反应明显，最终注射的脂肪被吸收导致失败。一些商品化的天然、合成或两者的混合材料也被用来代替脂肪组织，如矿物或植物油、石蜡、脱细胞真皮基质（Allo－ Derm）、自体或异体真皮组织、纤维蛋白凝胶（Fibrel）、透明质酸凝胶（Hylaform）、牛真皮胶原（Zyderm）、硅树脂、聚四氟乙烯、交联的聚二甲基硅氧烷（Bioplastique）等，虽然改善了患者的缺陷，但其远期结果不定，还可能发生纤维包裹挛缩、变态反应、机械耐力不理想、变形、移位、远期吸收消失等缺陷。因此，目前的方法效果有限，也不适于诸如乳腺切除后等大容积软组织缺失的修复。组织工程技术重建的脂肪组织可能是一个可选择的替代方案。脂肪组织工程的原理与皮肤组织工程基本相似，包括4个完整的部分，即细胞、三维支架、组织诱导物质和相应的培养方法（图18－1）。

图18－1　脂肪组织工程原理

目前技术构建的三维细胞－支架脂肪生成重组体，通过活体移植或体外激素刺激获得脂肪替代物。但活体诱导的维持时间和体外诱导的组织黏合性还不完全令人满意。

一、脂肪组织工程的种子细胞

虽然脂肪由多种不同细胞所组成，目前组织工程方法中所用细胞无一例外地选择脂肪细胞。

（一）成熟脂肪细胞

成熟脂肪细胞是脂肪组织的主要细胞，属于终末分化细胞，尽管在合适培养条件下，其增生能力相当可观，但由于其漂浮性和脆性大、机械抵抗力低，不能使用常规的分离、培养技术。因而不是脂肪组织工程的首选种子细胞。

（二）前脂肪细胞

前脂肪细胞（preadipocytes），也称脂肪前体细胞（adipocyte precursor cells）。存在于脂肪组织的间质血管碎片（stromal－vascular fraction，SVF）中。有学者认为它与脂肪间充质干细胞是两类不同的细胞。脂肪细胞的发育过程为多能干细胞→前脂肪细胞→多室脂肪细胞→成熟脂肪细胞。因此认为，前脂肪细胞作为一种生成脂肪细胞的过渡细胞，虽具有一定的增殖潜力和脂肪生成诱导分化能力，但缺乏多向分化潜力，一般不表达干细胞表面标志。但目前国内外脂肪组织工程文献中的前脂肪细胞也指脂肪来源的间质细胞和其他一些细胞系细胞。

前脂肪细胞是成纤维细胞样细胞，不含脂滴，体积小，有促血管生成特性，比成熟的脂肪细胞更能耐受缺血、创伤和细胞培养操作中的机械力，以常规方法操作也更容易培养、扩增。一定条件下，在体内与体外均可以增殖分化为成熟脂肪细胞。已经证实，用这种细胞构建的组织工程脂肪替代物移植后成活率高，远期效果好，吸收少。因而是组织工程脂肪较理想的种子细胞。但是前脂肪细胞体外培养时易老化，且随着传代次数的增加，会散失分化能力，从而限制了它的应用。目前报道的研究中主要使用吸脂或脂肪活检组织分离人前脂肪细胞。其基本方法是将吸脂术或活检获得的脂肪组织用PBS仔细冲洗以去除血细胞，然后剪碎，用0．075%～0．1%Ⅰ型胶原酶37℃水浴中振摇消化30～60min，含10%胎牛血清的M199重悬，4℃、200g离心5min，去上清，M199洗涤2次，1×103个／cm2接种培养。

不同解剖部位、性别、年龄及是否绝经等对细胞的品质有影响。另外，前脂肪细胞的黏附、活力和对不同微环境的反应仍需要进一步研究。

从切除脂肪垫的间质血管成分分离的这类细胞常常存在细胞异质性、低增生率和供体部位依赖的分化能力等不一致性。基础研究中还常使用鼠3T3－L1细胞系，即特征性的前脂肪细胞系，可以避免上述缺陷，使研究条件高度可重复。另外，3T3－F442A细胞系有在活体研究中使用的报道。

（三）脂肪间充质干细胞

它是与骨髓基质干细胞相似的具有分化为成熟脂肪细胞的一类成体干细胞，在脂肪组织中的含量达2%，数量可观。文献中名称复杂，有脂肪来源的间质细胞（adipose－derived stromal cells，ASCs）、脂肪来源的间充质干细胞（adipose－derived mesenchymal stem cells，ASCs）、脂肪来源的干细胞（adipose－derived stem cells，ADSCs）、脂肪组织源性干细胞（adipose tissue－derived stem cells，ADSCs）、脂肪源性中胚层干细胞（adipose－derived mesodermal stem cells，ADMSCs）等。文献均避免这些不同称谓的比较，但从组织工程细胞来源的角度讲，这些概念有不同的细微差别，但其本质可能都是不同分离培养方法获得的不同纯度的脂肪间充质干细胞。

它具有广泛的多向分化潜能，在不同的环境和相应细胞因子的作用下能向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞及心肌细胞定向诱导分化。原代培养有脂滴形成，传代后没有脂滴形成，并随着体外培养时间的延长，脂肪干细胞的间质细胞相关表型逐渐增加，表达间充质干细胞的标志CD29、CD44、CD59、CD105（SH2）、SH3、CD166等，但不表达CD106。目前分离方法获得的细胞还可能混杂不同比例的杂细胞成分，如周皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、Fb等。国内有研究表明，这种细胞表达一些内皮细胞标志，如Ⅷ因子免疫细胞化学染色约95%细胞呈强阳性、透射电镜见Weibel－Palade小体。

脂肪间充质干细胞来源相对容易，体外能大量扩增，不易老化，无血清培养基培养160代后仍保持脂肪生成能力。因而是非常有前景的脂肪组织工程种子细胞。分离培养方法与前脂肪细胞大同小异。将吸脂术或活检获得的脂肪组织剪碎，0．075%Ⅰ型胶原酶37℃消化60min，随后，0．25%胰蛋白酶消化10min。10%牛血清溶液中和胰蛋白酶、多次离心洗去胶原酶，过滤获得细胞沉淀物，离心洗涤后，用红细胞裂解液（NH4Cl溶液）室温作用10min。洗涤、离心后，以8×105个／cm2接种，含10%胎牛血清、100U／ml青霉素、25mg／ml庆大霉素的DMEM／F12（1∶1）培养基培养。传代时接种密度为8×103个／cm2。有人发现，在体外的脂肪形成潜力和重建脂肪替代物的能力方面，通过吸脂术获得的脂肪间充质干细胞比手术切除分离的脂肪间充质干细胞要好。

（四）其他干细胞衍生的脂肪组织前体细胞

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BSCs）是研究最广泛的成体干细胞，具有多潜能分化的特点。体外分离、扩增较容易，也是脂肪组织工程种子细胞的一种选择，有多篇文献报道。胚胎干细胞、脐血间充质干细胞、胎肝间充质干细胞也有被诱导转化为脂肪细胞的报道。

二、脂肪组织工程的支架材料

脂肪组织工程拥有恢复组织缺失容积和功能的潜能，这依赖于前脂肪细胞黏附到合适的支架。前脂肪细胞是锚着依赖细胞，支架必须适于细胞黏附、迁移和增生。支架材料的重要性在于为脂肪种子细胞提供黏附表面，模拟一定的外形，引导组织再生，并便于细胞－支架重组体的操作。可以用来做脂肪组织工程三维支架的材料有天然细胞外基质和可生物降解合成聚合物，它们可以被植入或注射到需要部位。应综合考虑力学特性、降解性质、免疫原性、细胞对材料的反应性、临床易操作性、价格等因素来选择支架。

（一）天然细胞外基质支架

已报道使用的天然细胞外基质有胶原凝胶、胶原海绵、胶原－壳多糖海绵、吸收性明胶海绵、Matrigel、共价连接细胞黏附肽RGD的藻酸盐、纤维蛋白凝胶、蚕丝蛋白三维支架、透明质酸酯衍生物多孔支架（HYAFF11）、人脱细胞胎盘基质、透明质酸凝胶等。大多数研究在活体进行，在植入点有脂肪组织形成。只有少数工作使用这些基质做三维培养，这些体外研究仅证明前脂肪细胞向含脂质的脂肪细胞转化，而并未获得黏合性良好的脂肪组织样结构，原因是体外无法模拟脂肪生成的生理环境。胶原来源支架细胞黏附性很好，但移植后存在的时间短，而蚕丝蛋白支架可以更长的时间维持软组织形状的完整性。

Kimura Y等将黏附有人前脂肪细胞的含缓释bFGF的明胶微球掺和到胶原海绵细胞支架中，移植到裸鼠背部皮下，6周后海绵支架中有脂肪组织形成。观察到细胞数量和bFGF浓度对脂肪组织形成的范围呈抛物线形影响，每个移植点细胞数为1．0×105个和bFGF浓度1mg是高峰。单独移植黏附前脂肪细胞的含缓释bFGF的明胶微球没有观察到脂肪生成。

（二）可生物降解聚合物支架

合成材料可以不受限制地重复制造，在脂肪组织形成研究中比天然细胞外基质更具有可重复性。主要使用生物可降解的合成泡沫，如PLGA、PLA，聚乙烯乙二醇双丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEDGA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乙烯对苯二酸酯（polyethylene terephthalate，PET）也有报道。接种前脂肪细胞的PLGA在活体能生成脂肪垫，但其维持时间尚不能令人满意。另外，与天然细胞外基质类似，体外诱导的脂肪替代物也缺乏组织黏合性。而且，因其过硬而可能引起患者不适，多数情况下它不是理想的选择，如做乳腺重建的支架。更恰当的选择可能是生物可降解性聚合物毛毡（biodegradable polymer felt）。

通过赋予PLGA携带缓释IGF－Ⅰ与bFGF，对重建脂肪中的细胞类型有显著影响。另外，在材料表面涂覆纤维连接蛋白或含精氨酸、甘氨酸及天冬酰胺组成的RGD短肽，调节细胞识别和吸附，影响内皮细胞迁移增加血管形成，使脂肪生成增加。

可生物降解微球可同时携带细胞和作为药物传递载体。已经证实，在不停搅动的生物反应器内，前脂肪细胞能黏附到微载体珠上，可抵抗生物反应器的低剪切力并能生长、分化。微球还能携带脂肪生成因子或血管生成因子。有研究表明，PLGA携带内皮细胞因子，持久释放达21d。微球直径可能影响前脂肪细胞的增生能力和脂肪生成能力。Choi YS等将黏附兔间充质干细胞的不同直径可注射PLGA微球在脂肪生成培养基中培养2周后，发现直径75～100μm微球组上的细胞增生和脂肪分化最佳；注射到裸鼠颈部4周后，直径100～150μm微球组形成的脂肪垫组织学最像裸鼠自身的脂肪组织。

有学者在不可生物降解合成材料聚四氟乙烯支架表面应用不同的细胞外基质成分（如胶原），前脂肪细胞均可吸附到支架上并增殖。

水凝胶性质的天然或合成材料可以通过温度或化学方式控制其凝胶固化作用，而且细胞能均匀分布在材料中，可以很方便地以液态注射到需要的部位。可用于软组织缺失的填充及乳房造型。透明质酸凝胶、藻酸盐凝胶可能是乳房脂肪重建支架的一个选择。

三、脂肪生成诱导物质

为了重建脂肪组织的天然结构，前脂肪细胞必须转化成分化的表型。前脂肪细胞－支架重组体的微环境将影响前脂肪细胞的分化和脂肪组织形成率。内源性和外源性生长因子、PO2、pH、细胞外基质上的黏附分子、支持细胞、微动力影响脂肪形成。已报道影响前脂肪细胞分化为脂肪细胞的化学因子中，糖皮质激素、生长激素、IGF－Ⅰ、胰岛素、前列腺素、甲状腺素促进分化；EGF、TNF－α、IL－11、TGF－α、TGF－β、γ干扰抑制脂肪分化；aFGF、bFGF、PDGF等因为没有阐明是直接还是通过血管生成间接影响前脂肪细胞的分化，结论相互有冲突。

目前实际应用中激活前脂肪细胞分化的方法，一是将构建的前脂肪细胞－支架重组体植入生理环境（活体），二是使用含胰岛素、糖皮质激素和提升细胞内第二信使cAMP水平的因子的培养基（体外）。有时还要添加激活转录因子过氧化物酶增殖激活受体－γ（PPARγ）的物质如吲哚美辛、曲格列酮（rosiglitazone）以促进成脂作用。体外常用的脂肪细胞诱导培养液为含10μg／ml胰岛素、1μmoL／L地塞米松、0．5mmoL／L异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）、200μmoL／L吲哚美辛、100ml／L胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素、2mmoL／L谷氨酰胺的DMEM／F12培养基。另一报道的脂肪生成诱导鸡尾酒配方为：100nmol／L胰岛素、0．2nmol／L T3、1μmol／L地塞米松、0．25 mmol／L IBMX和1μM曲格列酮。

Vashi AV等在自制的小鼠组织工程小室模型中，将FGF－2明胶缓释微球混入Matrigel或Ⅰ型胶原凝胶，注入移植小室，6周后，均形成新的脂肪组织（无细胞脂肪组织工程技术）。Stillaert F等将添加FGF－2、培养的人间质血管碎片（SVF）细胞、Matrigel充满小室，移植到小鼠上腹部。通过研究移植小室下新形成脂肪的来源，发现SVF的主要功能是产生诱导因子诱导形成新脂肪，而不是提供脂肪细胞前体细胞产生新的脂肪组织。也就是说，以前报道的组织工程方法构建的细胞－支架移植后所产生的新脂肪，是前脂肪细胞成熟形成的还是邻近组织长入的争论，天平向后者倾斜，这涉及脂肪组织工程的策略，可能诱导自身脂肪再生更重要。

四、组织构建和培养方法

使用的培养技术要能提供合适的条件促进前脂肪细胞－支架重组体的细胞黏附、生长和分化。脂肪组织工程的细胞接种是将前脂肪细胞悬液通过注射到支架或将支架浸泡在前脂肪细胞悬液里来完成的。培养方法分为静态培养和动态培养。如果提供动态培养条件，如使用旋转瓶等生物反应器，可防止接种细胞沉降、改善细胞的空间分布、提高接种效率。脂肪是一个高代谢活性组织，对不充足的营养和氧尤其敏感，动态条件可促进这些物质向细胞的传递，可改善组织工程脂肪替代物的特性。

目前大多数组织工程脂肪替代物研究中，血管化依赖移植后的血管长入，使移植物中心部位的营养受限。在脂肪替代物中同时诱生血管的研究还未取得突破。脂肪间充质干细胞既能分泌促血管生成因子（如VEGF），又能在一定条件下分化为血管内皮细胞。因此，有人设想寻找合适的培养诱导条件或将脂肪生成细胞与能经适当刺激分化为血管细胞的干细胞共培养，可进一步重建出适合移植并长期维持容积和活力的血管化脂肪组织替代物。

另有学者在小鼠、大鼠、兔和猪动物实验模型中重建了血管化的脂肪组织，其主要方法是：预先设计与所要修复缺损形状一致的塑料小室，放入皮下，分离合适的血管使其穿过小室，再加入混有脂肪干细胞、bFGF等特殊生长或分化因子的可生物降解基质（如从Engelbreth－Holm－Swarm小鼠肉瘤中提取的富含基膜物质和生长因子的细胞外基质Matrigel和从肌肉提取的含胶原、层粘连蛋白和生长因子的Myogel），缝合皮肤。4～8周后，小室中将填满带血管的与设计形状一致的脂肪组织。

五、组织工程脂肪替代物的评估方法

组织工程脂肪替代物的评估方法有HE观察细胞构成；油红O染色观察脂质储积；免疫组化检查细胞外基质成分，如层粘连蛋白等；扫描电镜观察细胞和材料结合的情况；3－磷酸甘油脱氢酶（Glycerol－3－phosphate dehydrogenase，GPDH）活性测定；细胞内三酰甘油含量测定；脂肪分解率测定；RT－PCR检测脂肪替代物中特征性的脂肪细胞基因，如PPAR－γ、Glut－4、瘦素（leptin）、β3－肾上腺素受体、层粘连蛋白－1β等的表达情况；ELISA法测定无血清培养基中的脂肪分泌因子，如瘦素、Adiponectin浓度等。通过这些指标，既可以了解材料对细胞的生物相容性，又可了解整个脂肪组织替代物的品质。

六、临床应用策略和展望

组织工程处理皱纹和软组织塌陷的策略是恢复导致异常轮廓的局部组织缺失。皱纹发生萎缩的解剖部位在真皮，逐渐累及表皮，因此，脂肪替代物的注射部位应在真皮和表皮之间；软组织缺失最初累及皮下组织，最终可能累及从表皮到皮下的所有区域，并在真皮和肌肉之间形成黏着性斑块，因此脂肪替代物注射或植入的部位应在肌肉和真皮之间。

另一个重建策略可能是注射黏附有前脂肪细胞和携带脂肪生成因子或血管生成因子的生物可降解聚合物微球或水凝胶。

最近，Melanie Vermette等提出基于细胞“自装配技术”的脂肪组织工程策略（cellbased tissue engineering strategy）。理论基础是将维生素C刺激人脂肪间充质干细胞产生的大量细胞外基质与诱导分化为脂肪细胞相结合。其方法是：在6孔板中以1．58× 105个／cm2接种人脂肪间充质干细胞，用含50mg／ml（250mmol／L）维生素C、10%胎牛血清的1∶1DMEM／F12培养基做常规培养，7d后用含250mmol／L维生素C、3%胎牛血清、100nmol／L胰岛素、0．2nmol／L T3、1μmol／L地塞米松、0．25mmol／L IBMX和1μmol／L曲格列酮的1∶1DMEM／F12培养基成脂诱导3d，再换成含10%胎牛血清、100nmol／L胰岛素、0．2nmol／L T3和1mmol／L地塞米松的1∶1DMEM／F12脂肪培养基培养。28d后将获得的数个膜片叠在一起继续培养7d，即可获得一定厚度的黏着良好的自体脂肪替代物。目前该方法仅有体外研究报道。

总之，脂肪组织工程还处于起步阶段，面临许多的挑战。一是目前的研究多在小型动物上应用，而临床需要修复的软组织缺损往往很大，其有效性还需要进一步探索。二是最科学的脂肪组织工程策略是细胞－支架重组体？是可注射复合体？是诱导脂肪原位再生？还是基于前脂肪细胞与大网膜碎片结合的脂肪再生？……这些还需要深入研究；三是如何使构建的脂肪组织长期保持活力，血管化的策略是需要充分考虑的问题。

（朱堂友　伍津津）

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