呼吸道感染性疾病的分子生物学诊断

呼吸道感染（RTI）是一种常见病、多发病，高居门、急诊就诊数的首位。据统计，我国每年有近5亿人感染呼吸系统疾病，7岁以下儿童平均每人每年患急性呼吸道感染3～4次。除一些病毒感染性呼吸道疾病外，常见的下呼吸道感染有社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎（HAP）、呼吸机相关肺炎（VAP）、医疗机构相关性肺炎（HCAP）、慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）等。对于这些疾病，合理用药，延缓耐药发展的前提条件是病原菌的正确诊断。

一、病毒性感染的诊断

1．呼吸道合胞病毒　呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是中等大小有包膜的负链RNA病毒。RSV侵入机体后，首先在鼻咽部黏膜内增殖，并引起呼吸道感染。通过RNA核苷酸序列分析，基因组至少有编码10种病毒的特异mRNA，其中7种蛋白基因存在于成熟的病毒体内。RSV基因组为不分节段的线性负链RNA，约15 000个核苷酸，可分10个基因片段，依次为3′－NS1－NS2－N－P－M－SH－F－G－M2－L－5＇，编码10个特异性蛋白。应用PCR技术扩增特异基因片段，可提高呼吸道合胞病毒RNA检测的敏感性。通过核苷酸序列分析，可将呼吸道合胞病毒的基因组序列得到阐明。在临床应用中，由于分子生物学技术的介入，为呼吸道合胞病毒感染的诊断提供了更加精确的诊断依据。

2．SARS冠状病毒　导致“非典”的SARS冠状病毒（SARSCoV）是与已知的人类或动物病毒完全不相关的“全新”冠状病毒。这种新的冠状病毒具有29 736个碱基（遗传物质的单位）。SARS病毒中对SARS感染起重要作用的蛋白质有6种：E蛋白、S蛋白、M蛋白、N蛋白、多聚酶和3CI蛋白水解酶。进一步研究表明，囊膜上一般有两种糖蛋白：S蛋白，M蛋白。其中S蛋白负责诱导病毒囊膜与宿主细胞膜的膜融合，激发机体产生中和抗体的体液免疫和细胞免疫反应。病毒内包有病毒的遗传物质RNA，长26～32kb，在所有RNA病毒中是最长的。另有核衣壳蛋白，称为N蛋白，它与病毒RNA的复制和出芽有关。当冠状病毒进入到宿主细胞中，首先翻译合成病毒的RNA聚合酶。在RNA聚合酶的指导下完成病毒感染的早期事件，进而实现病毒的转录、复制、翻译和新病毒的组装。目前应用PCR检测，其结果可以辅助临床诊断评价，但是不能肯定或排除疾病的可能。

3．禽流感病毒　禽流感病毒属于甲型流感病毒。流感病毒分属于正黏病毒科流感病毒属，分甲、乙、丙三型。外形多呈球状，直径80～120nm，有包膜，核内核酸是一单链RNA，分8个基因节段。根据外膜上血凝素（H，分H1－H15亚型）和神经氨酸酶（N，分N1－N9亚型）分为不同亚型，不同亚型之间毒力强弱不同，根据毒力强弱又可分为高致病性、低致病性和非致病性。引起各地疫情的是高致病性禽流感病毒，以H5和H7亚型（H5N1和H7N7常见）为主。

病毒检验应在BSL－Ⅲ级实验室内进行，常应用病毒培养分离、核酸扩增技术和血清抗体检测，实验室检测是诊断禽流感不可或缺的要素。凡是到过疫区或接触过病禽及带病毒动物的分泌物和排泄物，出现类似流感症状的人员，结合实验室检测结果可做出诊断。还有学者研究混合感染的多种亚型禽流感病毒的纯化和鉴定方法，发现用RT－PCR和血凝抑制试验两种方法同时鉴定病毒的纯化效果，可明显提高准确性。

4．甲型H1N1流感病毒　甲型H1N1流感病毒属于正黏病毒科（orthomyx－oviridae），甲型流感病毒属（Influenza virus．A）。典型病毒颗粒呈球状，直径为80～120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA和M2蛋白，病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10nm。流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组约为13．6kb，由大小不等的8个独立片段组成。尽管不同亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型，但是可造成人感染猪流感病毒的血清型主要有HIN1、H1N2和H3N2。

由于在症状上类似于普通季节性流感，因而甲型H1N1流感的确诊依赖于特异性实验室检测，因此特异而灵敏的检测方法是确诊甲型H1N1流感病毒感染的重要前提。甲型H1N1流感病毒RT－PCR核酸检测技术具有较高灵敏度和特异性，目前已应用于临床样本的检测。

二、细菌性感染的检验

1．脑膜炎奈瑟菌　脑膜炎奈瑟菌（neisseriar meningococcus，NM）是流行性脑脊髓膜炎的病原菌，用基因诊断方法检测脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌，对流脑的预防和控制具肩重要的意义。脑膜炎奈瑟菌基因组包含有4种复制的rRNA操纵因子（16s－23s－5s）和可携带20种氨基酸的59个tRNA基因。脑膜炎球菌的外膜蛋白基因有完整的开放阅读框架（ORF）、启动子区、终止子区和信号肽区。用于脑膜炎球菌基因扩增序列主要有两种：脑膜炎球菌全基因中特异性重复序列IS 1106的核心片段和外膜蛋白基因的靶DNA片段。利用上述片段设计引物，可以快速诊断脑膜炎奈瑟菌。

2．结核分枝杆菌　结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）可以导致全身性疾病，近几年结核杆菌的变异性较大，对抗结核药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高。近年来，结核病的诊断方法逐渐得到完善，将传统细菌学检验方法、免疫学方法和分子生物学的方法相结合，加速了对结核病的诊断研究。特别是分子生物学技术的发展，对于阐明分枝杆菌和结核分枝杆菌的遗传变异规律及分子进化等都有重要的意义。试验方法包括：结核杆菌DNA扩增法（PCR法）、实时荧光定量PCR技术、PCR－RFLP（限制性片段长度多态性）、DNA探针技术、生物芯片检测、PCR结合斑点杂交等。

3．嗜肺军团菌　嗜肺军团菌（legionella pneumophila）为胞内寄生菌，其致病性直接依赖于胞内寄生能力。当细菌侵入体内后，一般先被中性粒细胞和巨噬细胞吞噬，但不能将细菌杀死，反而有利于扩散。军团病（legionnaires＇disease）是由军团菌感染引起的一种急性传染性疾病，因其临床表现不易与普通细菌性肺炎相区别，故临床上常致误诊，未经及时诊断和有效抗生素治疗的患者，病死率较高。嗜肺军团菌特异性靶序列有：特异性DNA序列、编码毒力蛋白的mip基因、5sRNA、16sRNA基因等。PCR技术用于嗜肺军团菌感染的诊断是一项很有应用前景的方法。

三、真菌感染检验

1．白色念珠菌　白色念珠菌（candida．albicans，CA），用于念珠菌基因扩增的特异性引物序列主要是：细胞色素P450基因序列、EOB基因序列和rDNA基因序列。

对白色念珠菌核型分析结果证实有7～12条染色体，大小在0．42～3．0Mbp。对白色念珠菌以DNA分型时，可至少分为6个型；采用脉冲场凝胶电泳分型，至少可分为13个型。在实验室诊断念珠菌感染方面，已经筛选出几种念珠菌种、属特异性DNA探针，其中Ca3多态性探针对临床分离株的分型有重要价值。有关PCR检测念珠菌属、白色念珠菌临床株的已有不少文献报道，采用的引物序列可为细胞色素P450、rDNA等区域。PCR通过用两对基因片段进行体外扩增，能将白色念珠菌与其他念珠菌感染区分开来，使我们对念珠菌感染的检测诊断提高到基因水平。

2．新型隐球菌　新型隐球菌（cryptococcus neofrrnans，CN）是一种条件致病性真菌，近年来，由于激素、抗生素及免疫抑制剂的应用，造成免疫功能减退成为隐球菌病的主要诱因，使其感染逐年增长。新型隐球菌可分为5个血清型。基因组染色体总长度为10～15．7Mbp。目前用于新型隐球菌基因扩增的特异性引物序列，来自新型隐球菌全基因组的URA保守区序列，用于新型隐球菌的PCR扩增，敏感性可检出10个菌细胞，并具有较高的特异性，临床脑脊液标本的阳性检出率达93．3%。该方法对新型隐球菌脑膜炎的早期诊断具有重要的临床意义。

3．曲霉菌　近年来，由于大量抗生素、免疫抑制药或皮质类固醇的广泛应用，曲霉菌引起的条件致病性感染日趋多见。当机体发生改变或免疫力低下时，引起侵袭性肺曲霉菌感染，通过肺组织，经血循环至全身，引发播散性曲霉菌病，引起多器官感染。曲霉菌属大约有10多种，能构成临床上条件致病性的以烟曲霉菌最为多见，其次为黄曲霉菌、黑曲霉菌及土曲霉菌，而其他曲霉菌极为少见。18SrRNA基因片段为曲霉菌属共有的编码基因，可针对大部分曲霉菌。根据曲霉菌属共有的编码基因18SrRNA片段设计属特异性引物序列，建立曲霉菌属PCR检测方法，可在3～4h内得出结果。

四、其他呼吸道病原体感染的检验

1．肺炎衣原体　肺炎衣原体（C．pneumoniae，CP）是人类急性呼吸道感染，特别是肺炎的常见病原体。目前用于肺炎衣原体基因扩增的序列主要来自全染色体基因序列。据此确定肺炎衣原体的特异性引物，可快速检测肺炎衣原体DNA，其敏感性可检出10fg的肺炎衣原体DNA，特异性达100%。

2．肺炎支原体　肺炎支原体肺炎（mycoplasmal pneumonia）是由肺炎支原体（mycoplasma pneumomiae）所引起的呼吸道感染，有咽炎、支气管炎和肺炎。支原体经口、鼻的分泌物在空气中传播，引起散发的呼吸道感染或者小流行。用于肺炎支原体基因扩增的靶基因序列有：肺炎支原体PI蛋白基因序列、16SrRNA基因的可变区及染色体基因等。支原体分子生物学检测方法有基因探针和聚合酶链反应（PCR）等方法。基因探针的核酸杂交法，虽然敏感性和特异性都很高，但基因探针常用核素标记，放射性危害大，设备要求高且操作繁琐难以推广，近年来发展的PCR技术，主要有快速循环PCR、PCR－RFLP（限制性片段长度多态性分析）、PFGE（脉冲场凝胶电泳）、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析、基于NASBA（基于核苷酸序列的扩增）的分析及16S－23SrRNA基因间隔区序列分析等方法。有助于深入了解肺炎支原体的生物学特性，对其致病机制和流行病学的研究提供帮助。

3．卡氏肺孢子虫　卡氏肺孢子菌（pneumocystosis carinii PC），广泛存在于人和其他哺乳动物的肺组织内，是一种机会性致病原虫，可诱发卡氏孢子虫肺炎（PneumocystiscariniiPneumonia，PcP），常见于免疫功能减退人群，尤其是CD4＋T细胞功能缺陷者。近年来，DNA探针、rDNA探针和PCR技术等分子生物学技术已试用于肺孢子虫病诊断。根据卡氏肺孢子虫基因组中，靶序列为编码rRNA大亚基因的部分线粒体rDNA，来自于重组质粒PAR102计设引物，进行扩增，用于快速诊断。PCR不仅可用于诊断PcP，还可检出亚临床型感染和播散性的肺外感染，并可用于PcP的流行病学调查，甚至可以监测PcP的临床治疗效果。目前套式PCR（Nested PCR）敏感性和特异性更高。许多学者采用PCR扩增P．c．靶基因，Southern印迹法检测PCR产物以提高检测的敏感性，但直接将杂交技术用于PcP诊断者甚少。还有报道以P．c．rRNA作为分子杂交的靶核酸，设计合成与之互补的生物素化的寡核苷酸探针用于原位杂交（ISH），检测患者肺组织中的P．c．，敏感性和特异性均较高，能补充传统染色和MAb免疫组化法，是诊断PcP的有用工具。