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逆转录机制复制

时间:2022-02-12 理论教育 版权反馈
【摘要】:逆转录是RNA病毒的复制形式之一,需逆转录酶的催化,因此RNA病毒也称为逆转录病毒。RNA分解后剩下的单链DNA再用作模板,由逆转录酶催化合成第2条DNA互补链。逆转录酶和逆转录现象的发现是分子生物学发展中的重要事件,发展了中心法则。在传统的中心法则中,DNA兼有遗传信息的传代和表达功能,因此DNA处于遗传信息流动的中心位置,而逆转录现象说明至少在某些生物,RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。

逆转录(reverse transcription)是以RNA为模板合成DNA的过程,即RNA指导下的DNA合成。逆转录的信息流动方向(RNA→DNA)与转录过程(DNA→RNA)相反,故称为逆转录。逆转录是RNA病毒的复制形式之一,需逆转录酶(reverse transcriptase)的催化,因此RNA病毒也称为逆转录病毒(retrovirus)。艾滋病病毒(HIV)就是典型的逆转录病毒。

逆转录酶通常具有多种活性:RNA指导的DNA聚合酶活性、DNA指导的DNA聚合酶活性和RNase H活性,有些逆转录酶还有DNA内切酶活性,这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。RNA指导的DNA合成需要RNA为引物,多为赖氨酸的tRNA,也有报道病毒自身的tRNA可用作复制引物。逆转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由逆转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

从单链RNA到双链DNA的生成可分为3步:首先是逆转录酶以病毒基因组RNA为模板,催化dNTP聚合生成DNA互补链,产物是RNA/DNA杂化双链(duplex)。然后,杂化双链中的RNA被逆转录酶中有RNase活性的组分水解,感染细胞内的RNase H(H:Hybrid)也可水解RNA链。RNA分解后剩下的单链DNA再用作模板,由逆转录酶催化合成第2条DNA互补链。

图9-20 逆转录酶的复制机制

①tRNA引物在5′-端延伸生成DNA互补链;②RNase H降解掉DNA-RNA杂合链中的RNA;③cDNA与3′-端的R序列互补配对(第1次跳跃);④延伸DNA链;⑤多数DNA-RNA杂合链中的RNA被去除;⑥3′-端的第2链DNA合成;⑦最后的杂合链RNA和tRNA引物被去除;⑧第2次跳跃,PBS互补配对;⑨两条DNA合成完成

按上述方式,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息,并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下,前病毒基因组通过基因重组的方式整合至细胞基因组内,并随宿主基因一起复制和表达。前病毒独立繁殖或整合,都可成为致病的原因。对逆转录病毒的研究,拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。鸡肉瘤病毒是1911年发现可使动物致癌的病毒。

逆转录酶和逆转录现象的发现是分子生物学发展中的重要事件,发展了中心法则。在传统的中心法则中,DNA兼有遗传信息的传代和表达功能,因此DNA处于遗传信息流动的中心位置,而逆转录现象说明至少在某些生物,RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。

分子生物学研究还应用逆转录酶作为获取基因工程目的基因的重要方法之一,即cDNA法。取得RNA后,用逆转录酶催化dNTP在RNA模板指引下的聚合,生成RNA/DNA杂化双链;用酶或碱把杂化双链上的RNA除去,剩下的DNA单链再作第2链合成的模板;利用Klenow片段催化dNTP聚合,第2次合成的双链DNA称为cDNA。现在已利用该方法建立了多种不同种属和细胞来源的含所有表达基因的cDNA文库,方便人们从中获取目的基因。

图9-21 线粒体DNA的D-环复制方式

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