同工酶类型的鉴别

12．2．2　同工酶类型的鉴别

从同一组织或不同组织中分别提取的能催化相同反应的酶，究竟是结构完全相同的同一种酶还是结构不同的同工酶？是原级还是次级同工酶？当在技术上还不能测出全部一级结构时，可以用较简易的方法，如末端分析、水解后肽链的指纹图谱等加以鉴定，或者将上述各项方法的鉴定结果加以综合分析，也可获得较为可靠的结论。

从表12－2（引自袁勤生．现代酶学．2版．上海：华东理工大学出版社，2007）可见，不论原级或次级同工酶，因酶蛋白的等电点或相对分子质量不同，电泳速度通常也不同。不同糖链，特别是糖链末端唾液酸数量不同的次级同工酶，或者聚合程度不同的次级同工酶，也可分别因糖链的电荷不同及酶蛋白的相对分子质量不同而有不同的电泳速度。但如果复等位基因同工酶中只有非极性氨基酸的交换变异，或其碱性氨基酸置换成酸性氨基酸的同时伴有等量的酸性氨基酸置换成碱性氨基酸，可以没有电泳速度的改变。同样，在形成次级同工酶时，如修饰过程不引起酶分子电荷或相对分子质量的改变，也不会改变等电点和泳速。此外，同一型复等位基因同工酶的电泳速度有个体差异，而不同型复等位基因同工酶的泳速也不成等差级数，后一性质类似于次级同工酶。离子交换层析的原理和电泳相同，故其应用于鉴定同工酶的价值也和电泳一样。

表12－2　三类同工酶在性质上的区别

①指纯聚体；②少数情况下可交叉。

热稳定性在鉴别同工酶类型上也有一定意义，其灵敏度有时可超过电泳。原级同工酶的热稳定性大多不同，其中复等位基因同工酶的热稳定性有时可区别很大，有时则比较接近，取决于置换氨基酸的多少及种类，次级同工酶也视不同的修饰情况可以接近或不同。实验证明，糖链不同的次级同工酶，其热稳定性常有区别。

动力学性质的测定是区别原级或次级同工酶较好的手段，因原级同工酶的各项动力学参数包括底物的K_m、抑制剂的K_i、激活剂的K_a常不相同，有时尚有别构效应和无别构效应的区别。如丙酮酸激酶中的L型和K型对底物磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvic acid，PEP）均是正协同别构效应，而M型则无别构效应而呈米氏动力学。次级同工酶的蛋白质结构因差别很少，故其动力学参数往往相同或比较接近，如L型和R型PK。但在少数情况下也可不同，如AKP，在不同浓度的底物（β－萘酚磷酸）时，其最适pH均不相同，如在不同底物浓度各自相应的最适pH条件下测定反应速度，可发现肝、肾、骨中三型AKP的Km略有不同。

免疫性质是区别两类原级同工酶最好的方法，多基因位点的同工酶常有不同的免疫特异性。如三类LDH和三类ALD的亚基以及两类CK的亚基。不同亚基只能与本身相应的抗体起反应，彼此无交叉免疫，只有个别例外。如M型PK的抗体虽然不能和L型PK结合，却能和K型PK反应，故有人将K型PK称为M2型PK，但其免疫沉淀线并不融合而是相互交叉。复等位基因同工酶往往有相同的免疫决定簇，可交叉免疫。如果两个同工酶的动力学不同而免疫性相同，往往提示是复等位基因同工酶。当因遗传变异而产生某一同工酶的变种，没有催化活性或活性极低，用其他方法无法检测，此时用这种同工酶正常型的抗体与此变异酶发生免疫反应，就可证明此同工酶的存在，故免疫法在检出复等位基因同工酶中有独特的优点。

次级同工酶的一级结构基本相同，故其免疫性质也往往相同。肝、胎盘、肾、肺、小肠等组织中的芳香酰胺酶（aromatic amidase，AAD），虽然其电泳迁移率和热稳定性有所差别，但其动力学和免疫性质是相同的。各组织的AKP各有不同的电泳图谱，但利用免疫法鉴定只有三种类型，见表12－3（引自袁勤生．现代酶学，2版．上海：华东理工大学出版社，2007）即肝型、胎盘（晚期）型和小肠型三型原级同工酶，而骨型、肾型乃至早起胎盘型和肝型之间都有交叉免疫，其动力学性质也十分相似，故一般认为它们可能是次级同工酶。

表12－3　人肝、胎盘、小肠中纯化的AKP的酶学及免疫学性质

①如抗体浓度适当，可消除交叉反应。PNPP：对－硝基酚磷酸酯。