－和，－的鉴别

13．4．1　Mn－SOD和Cu，Zn－SOD的鉴别

Cu，Zn－SOD，Mn－SOD及Fe－SOD的共同生物学性质都是催化歧化为H₂O₂和O₂，因此用同样测定方法只能鉴别SOD活性，而不能区分SOD是含有何种金属的酶。要分别鉴别出与测定三种酶活性，必须采用根据这三种酶的性质不同而确定不同步骤的测定方法。

在真核生物中，Cu，Zn－SOD常存在于细胞浆，而Mn－SOD则存在于线粒体，故区分这两种SOD是生物学与医学研究中可能遇到的实际问题。在研究中首先要鉴别出Mn－SOD与Cu，Zn－SOD的存在。在这方面，最好的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳的染色定位法。由于这两种酶的相对分子质量与所带电荷的性质差异，故可以在凝胶片上区分成不同带而予以鉴定。由于Mn－SOD不受1mmol/L氰化物抑制，而Cu，Zn－SOD活性可被氰化物抑制而丧失，故加入氰化物可以进一步鉴别。

加入氰化物还可应用于分别测定Cu，Zn－SOD与Mn－SOD的活性。Vanneste等还进一步提出了氰化物抑制不完全的校正办法。Geller与Winge改用SDS处理法除去Mn－SOD，从而可鉴定并测定Mn－SOD与Cu，Zn－SOD。氰抑制法和免疫学测定结果相比较，证明SDS法测定结果与后两种方法基本一致（表13－12）。用SDS法测定线粒体与溶菌酶中Cu，Zn－SOD与Mn－SOD，证明该法测定Cu，Zn－SOD的结果较用氰抑制法更为准确（见表13－13）。

表13－12　氰抑制法、免疫学法与SDS处理法测定Cu，Zn－SOD与Mn－SOD的比较

表13－13　氰抑制法与SDS处理法测定线粒体与溶菌体部分中SOD活性结果的比较

虽然有学者认为只要将SOD的区分方法与SOD的活性测定方法相结合，就可以测定生物样品中Mn－SOD的活性，但是否所有的SOD活性测定法都可以与两种SOD区分法相结合应用于Mn－SOD活性测定却很少有报道。

赵厚安、方允中比较了细胞色素c还原、四氮唑蓝还原、光化学扩增、化学发光和亚硝酸生成五种测定SOD的方法。结果表明，化学发光法和光化学扩增法都不能与氰抑制或SDS处理相结合应用于Mn－SOD测定；四氮唑蓝法和细胞色素c还原法可应用于Mn－SOD测定，但专一性和灵敏度不够理想。亚硝酸盐法具有专一性强、灵敏度高、结果稳定、重复性好、操作简便等优点。如Mn－SOD回收率，氰抑制法为96%～100%，SDS处理法为84%～100%，表明氰抑制法和SDS处理法均不干扰SOD测定反应系统（见表13－14）。

表13－14　用亚硝酸盐测定Mn－SOD的回收率

不同pH值法：改变pH的方法也可区分两者。Cu，Zn－SOD与Mn－SOD在pH＝10．2与pH＝7．5时活性比值是不同的，前者为10，而后者为2。例如两种酶混合液在pH＝10．2及pH＝7．5时的活性比值为5，则可计算出Cu，Zn－SOD的量：Cu，Zn－SOD（%）＝［（5－2）/（10－2）］×100%＝37．5%。本法对于Mn－SOD活性的检测亦不理想，因为在pH为10．2的条件下，总SOD活性中Mn－SOD的活性仅占极少部分。

DDC法：二乙基二硫代氨基甲酸盐（diethyldithiocarbamate，DDC）能够与铜形成复合物，并将Cu辅基从Cu，Zn－SOD中除去，从而使Cu，Zn－SOD失活。

方法与步骤：①将待测样品分为两份，一份作为对照，另一份中加入终浓度为50mmol/L的DDC，在pH为7．8、30℃的条件下孵育1h。②将两份样品经Bio－Rad Econo－Pac 10DG柱过柱（用50mmol/L磷酸钾缓冲液，pH为7．8，含0．1mmol/L EDTA，平衡及洗脱）脱盐，或对400倍体积的5mmol/L磷酸钾缓冲（pH为7．8，含0．1mmol/L EDTA）透析，换液三次。③测定两样品中的SOD活性，未做处理的一份为总SOD活性，DDC处理的一份为Mn－SOD活性，两者之差为Cu，Zn－SOD活性。

DDC对Mn－SOD的活性无影响，5mmol/L DDC于30℃下处理1h，可使99%以上的纯化Cu，Zn－SOD失活。在组织粗提液中，10mmol/L的DDC可抑制SOD活性达90%，30℃用50mmol/L的DDC处理1h，可完全抑制纯化的及组织粗提液中的Cu，Zn－SOD活性。DDC法测定的Cu，Zn－SOD及Mn－SOD活性结果更为准确。在细胞色素c还原法测定SOD时，DDC可引起空白本底的值增加5倍，因此测定过程中空白对照不可缺少，空白值的影响不可忽略。