同工酶形成的结构基础

12．1．1　同工酶形成的结构基础

同工酶之所以能够催化相同的反应，是因为其在活性中心的结构上有类同之处，而它们之所以存在着物理特性、催化性质以及免疫特异性的区别，也由于在分子组成和结构上有一定的差异。

12．1．1．1　同工酶一级结构的差异

同工酶在一级结构上的差异大致有三种情况。

（1）相对分子质量不同，氨基酸组成相差悬殊。例如细胞膜上有两种半乳糖苷转移酶同工酶Ⅰ和Ⅱ，它们的相对分子质量分别为54　000和76　000，其氨基酸组成、含糖量及糖链组成相差甚大，电泳、层析、底物特异性和某些动力学参数也十分不同，可以想象，它们有不同的免疫特异性和不同的水解肽谱。

（2）相对分子质量接近，但氨基酸组成及水解后肽谱不同，免疫性质也不同。如兔醛缩酶（alodolase，ALD）的A亚基和C亚基，相对分子质量分别为40　000和37　000，以及大鼠丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）的L亚基和M亚基（相对分子质量约为60　000）都属于这种情况。

（3）相对分子质量接近，氨基酸组成类似，水解后肽谱也较近似，但免疫性质不同。如乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的A（M）亚基和B（H）亚基（相对分子质量约为35　000）以及ALD的A和B亚基（相对分子质量约为39　000）都属于这一类。LDH是研究最深入的一组同工酶，猪和鸡A亚基和B亚基及狗鱼的A亚基的一级结构均已阐明。其中猪的LDHB有331个氨基酸残基，LDHA有329个氨基酸残基。对照A、B两亚基其同一性在75%左右，活性中心附近接近辅酶或底物各氨基酸残基十分类似。

12．1．1．2　构象变化造成同工酶的差异

一级结构相同的同工酶，可以存在不同的构象，形成所谓构象同分异构体（conformational isomer或conformer）。虽然从牛胰核糖核酸酶可逆变性后重新复性（renaturation）的工作证明了蛋白质的空间构象取决于它的一级结构，但不能排除在一级结构不变的条件下，可以有一种以上稳定的构象，而一般天然蛋白质只是存在于最稳定的构象而已。实验证明：小鸡线粒体中的苹果酸脱氢酶M（malate dehydrogenase m，MDHm）加入微量的碘后，并不会引起分子的碘化，却可发现电泳速度和旋光色散的改变，提示有构象的变化，并证明天然状态的MDHm具有最少的表面负电荷和最多的α－螺旋区域。同样，用胍使MDHm变性后，再去除胍使酶复性，电泳速度可与天然酶一样，而热稳定性有所不同，也可能因构象不同所致。这类构象同分异构体还包括谷氨酸草酰乙酸转氨酶M（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT m），MM型肌酸激酶（creatine kinase，CK），以及红细胞中的ACP。这类同工酶的不同构象可以相互转化，又称为互变性同工酶（interconvertible isozyme），属于次级同工酶的一种类型。为了有别于不能互变的原级同工酶，故后者又称为不互变性同工酶（non－interconvertible isozyme）。

但是，别构酶（allosteric isozyme）在加入效应剂后引起的别构效应也有酶分子空间构象的变化，有人认为这是暂时性的变化，当别构剂去除后可复原，故不能属于次级同工酶的范畴。

Harris曾统计了100多种亚基数目，发现单亚基的占30%，多亚基的占70%。在多亚基中，最多是双亚基的占43%；而三亚基及四亚基的各占4%和24%。

12．1．1．3　同工酶亚基的杂交

同工酶的亚基在一定条件下能解聚为单体，又能在一定条件下重新聚合或重组成新的杂交体。

（1）体外杂交。在高离子强度的介质中反复冻融或调节介质的pH可使同工酶的纯聚体解聚成单体，并再重组而生成杂交体。亚基杂交只限于同一种酶的亚基，如LDHA4和LDHB4解聚后可生成A、B亚基的杂交体，但LDH的亚基不能和ALD或PK的亚基杂交。不同种属中同一种酶的不同亚基则可在体外杂交，如鸡的M型PK可与牛的L型PK杂交。因亚基的重组是随机的，故重组后生成同工酶的数目（包括原来的纯聚体在内）应符合随机分配的数学公式，即

式中，n为每一酶分子的亚基数；s为可杂交的亚基种类数。例如某一种酶为四聚体，有三种不同的亚基均能杂交，则杂交后应形成（4＋3－1）！/［4！（3－1）！］＝15种同工酶，其中12种为杂交体。

（2）体内杂交。同种或异种动物中同一种酶的亚基在体外虽都杂交，但体内并非如此。如ALD－A₄和ALD－B₄可在大鼠肾脏中形成A₃B，A₂B₂，AB₃三种杂交体；ALD－A₄和ALD－C₄也可在大鼠脑中形成A₃C，A₂C₂，AC₃三种杂交体，但鸡肾中有A，B，C三种亚基，其中AB，AC可以杂交，却无BC的杂交。与此相似，成年鼠肾、小肠或胎肝中的PK，可发现K亚基和L亚基的纯聚体及杂交体，胎鼠骨骼肌的新生鼠脑也有K亚基和M亚基的杂交体，甚至L′亚基也可在胎肝中和K亚基杂交，但从未发现有L和M两型亚基的杂交。

同工酶亚基在有些组织中不能杂交的原因，可能有以下几个方面。

①为不同亚基编码的基因，在有些组织中不全表达。例如在鼠肾中不能合成ALD的C亚基，鼠脑中不能合成B亚基，因此鼠肾中没有AC杂交，鼠脑中也没有AB杂交。同样，能合成L及K型PK的鼠肾、肝脏和小肠不能合成M型PK，而合成M型的骨骼肌及脑却不能合成L型PK，这就是没有LM杂交体的原因。

②能表达的不同亚基在不同的细胞中合成。如有人证明L型PK和K型PK几乎分别在肝实质细胞和柯否氏细胞中合成，故肝脏中没有PK和LK的杂交体，但在肾脏及小肠黏膜上皮细胞中，L亚基和K亚基可在相同的细胞中合成，因而可能有LK杂交体。

③不同亚基虽在同一细胞，但却在不同的亚细胞组分中合成。如线粒体内外的MDH及GOT也不能形成杂交体。有人认为，只存在于成熟睾丸及精子中的LDHC亚基在线粒体中合成，而A、B两亚基在胞液中合成，这可能就是除豚鼠外的大多数动物中C亚基没有杂交体的原因。故睾丸只较其他组织多一个C4酶带，即LDHx，其电泳速度一般在LDH3或LDH4之后，因动物种类而异。

④不同亚基即使在同一亚细胞组分中合成，但其基因不在同一时间内开放，因此不同亚基也没有聚合的机会。睾丸和精子中没有C亚基杂交也可能由于A、B亚基和C亚基的合成不同步，而先合成的亚基又没有多余可以与后合成的亚基杂交。

（3）同工酶亚基在体内的聚合机制。蛋白质亚基的解离和聚合是生物化学中十分重要而有趣的课题。在研究血红蛋白（haematoglobin，Hb）四级结构的形成机理时发现，Hb合成时，多核糖体上先合成含141个氨基酸残基的α亚基，接着与未完成的β亚基合成αβ杂交二聚体，待含146个氨基酸残基的β亚基合成完全后，再与另一个αβ亚基形成α2β2四聚体。免疫球蛋白（immune globulin，Ig）的合成是先合成轻链（L）和重链（H）的杂交体HL，待H链合成完成后，HL脱下，再形成H₂L₂的Ig分子。上述过程保证了在正常情况下只有2∶2杂交，而不会形成纯聚体及1∶3的杂交体，否则就是不正常的病理情况。但同工酶不同，它既有纯聚体，又有1∶3的杂交体，说明同工酶的亚基聚合机理有其独特的地方。不少学者还提出同工酶在刚合成时以单体存在，然后随机聚合，如大鼠心肌中烯醇化酶的两种亚基α和β含量相等，三种同工酶αα∶αβ∶ββ的比值为1∶2∶1，和体外杂交一样。也有人提出，在同工酶合成时可先合成纯聚体再通过亚基交换而形成杂交体，但亚基交换仅在体外证实，而在体内尚无足够的证据。在研究LDH同工酶在心肌、骨骼肌和肝脏等组织中的代谢转换率时发现，LDH亚基聚合并不是随机的。事实上，在A和B亚基各占50%的组织中，LDH同工酶的比值也不一定是1∶4∶6∶4∶1的对称性分布，因此很有可能同工酶亚基的聚合另有特殊机制。

12．1．1．4　同工酶与基因

关于酶和基因的关系，早就有人提出一个基因决定一个酶的假设。事实上，酶不是基因的直接产物。从基因到酶，即DNA到蛋白质，中间还要经过转录和翻译过程。业已证明，基因通过转录、翻译合成特异的酶，所以从本质上说，同工酶结构的差异主要来自基因的差异，只有一部分同工酶是在多肽链合成后它的结构再经过改变而来的。

根据同工酶的来源和结构不同，从基因角度可将它分为四类。

（1）单基因决定的同工酶。产生这类同工酶的基因是不同的，它们大都是结构差异较大的单链酶或同聚体酶。例如过氧化物酶，它属于单体酶，在植物的不同部位和不同生长发育期可以合成多种过氧化物同工酶。

（2）多基因决定的同工酶。这类同工酶的基因是由两个或两个以上的基因决定的，是由几条不同的多肽链组成的，它们都是异聚体酶。如LDH是四聚体酶，由两个基因LDHA和LDHB决定的肽链A和肽链B组成。这两种多肽链可以通过异聚和同聚方式构成5种同工酶。

要知道多基因决定的同工酶总数（i），可以由决定同工酶的基因数（L）以及酶的多肽链数（n）用下式算出：

人肝的醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）有三个基因位点：ADHA、ADHB和ADHC，产生三种肽链，而酶为二聚体，故可以构成6种同工酶。

（3）复等位基因决定的同工酶。由于同一基因位点的多向突变，造成群体的不同个体之间等位基因的差别，产生多肽链一级结构的差别，而使个体与个体之间出现结构不同的同工酶。如玉米中酯酶受同一位点的ES、EN和EF三种等位基因所控制，是二聚体。

如果酶中的多肽链是复等位基因决定的，则计算式为：

式中，h为等位基因数。

上述玉米中酯酶，如有一个杂合子EF/EN，h＝1，则它的同工酶总数为3，同工酶多肽链的组合为EF、FN和NN。

以上计算只说明在群体中或整体生物的全生长发育过程中，一特定同工酶可能出现的理论总数，而在实际材料和分析中不一定能把所有的同工酶组合找到，特别是那些差别甚微的等位基因决定的同工酶，因为目前的电泳分离技术有一定的局限性。

（4）修饰同工酶。这是指多肽链合成后，再发生结构上的改变而形成新的同工酶。有日本学者证明，一种水稻酯酶同工酶的谱带A1是受一个显性基因控制的。在对有A1谱带的品种与无A1谱带的品种杂交后代所做的遗传分析表明，有典型的孟德尔分离现象出现。在总数为836个F2植株中，629个出现A1谱带，207个无A1谱带。由此可见，同工酶谱带是受等位基因或不同位点基因控制的。也有实验证实，玉米过氧化氢酶是四聚体蛋白，在一定条件下可以解聚，再重新组合成5种同工酶，并且证明单体是最初的基因产物，这些单体聚合成四聚体后才具有酶活性。现将同工酶与基因的关系总结如图12－1。

图12－1　同工酶与基因的关系

（引自袁勤生．现代酶学．2版．上海：华东理工大学出版社，2007）