指纹与身体发育基因关联

第三节　基因诊断的应用

随着基因诊断方法学的不断改进更新，基因诊断已被广泛地应用于遗传病的诊断中，如对有遗传性疾病危险的胎儿在妊娠和产前诊断时，一旦确诊即可终止妊娠，杜绝患儿出生。基因诊断具有高度的敏感性和特异性，且简便、快捷，因此在病毒、细菌、支原体、衣原体、立克次体及寄生虫感染诊断中也得到了广泛应用，特别在病毒性传染病的诊断中发挥了不可代替的作用。此外，基因诊断在肿瘤病变机制研究、诊断、分类分型和预后检测方面也发挥重要作用。基因诊断还应用于器官移植组织配型和法医中的个体识别和亲子鉴定。

一、遗传病的基因诊断

已有近百种遗传病可用基因诊断技术进行诊断和产前诊断。对于致病基因的结构部分或全部清楚的可采用直接诊断策略，即采用基因突变的诊断方法，通过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病发生的各种基因突变。

目前，已有相当部分的单基因病可以进行基因诊断，这些疾病的共同特点是疾病的性质及致病基因的染色体定位已经明确，基因的DNA序列已全部或部分弄清，因此可用基因特异性探针或特异性引物进行检测，常用的检测方法有：RFLP分析法、斑点杂交法、PCR产物直接测序分析法。如镰状细胞贫血症是由于β^－珠蛋白基因第6位密码子发生A→T碱基替换，谷氨酸被缬氨酸所取代所致。该突变导致限制酶MstⅡ识别位点的丢失，采用Southern印迹杂交，βA出现1.15kb和0.2kb两条杂交条带，而βS出现1.35kb一条杂交条带。也可PCR/限制性酶切分析法检测该突变进行诊断。又如：苯丙氨酸羟化酶基因突变可引起苯丙酮尿症，腺苷脱胺酶基因突变可引起重症联合免疫缺陷症（SCID），而淋巴细胞表面分子CD40或其配体（CD40L）基因突变则可引起无丙种球蛋白血症，均可采用相同的基因突变方法进行诊断。而α－珠蛋白生成障碍性贫血（α－地中海贫血）的共同特点是α－珠蛋白mRNA水平降低，因此采用RT－PCR方法检测患者的mRNA含量，是α－珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断的有效方法。

对于致病基因尚未确定的可采用间接诊断策略。即采用多态性连锁分析的方法，寻找相关遗传“标记物”。如高血压、自身免疫性疾病等，都可能与某个或某些遗传位点的持有或改变有关。用基因诊断的方法检测这些位点的改变，不仅对临床诊断，而且对疾病的病因和发病机制的研究都具有重要的意义。

尽管多基因病的遗传基因较为复杂，但在不少多基因病中往往只有一个或少数几个遗传基因起主导作用，这就为多基因病的分子生物学研究提供了重要途径，使人们有可能应用分子生物学技术从部分基因位点着手寻找多基因病的致病基因。一种途径：是寻找疾病大家系，应用随机RFLP、微卫星等连锁标记，开展广泛的家系研究，就有可能发现与疾病易感性有关基因的连锁关系，这时通过逆向遗传学方法可以鉴别该基因。通过这种途径，已经鉴别出一些乳腺癌、结肠癌和胰腺癌遗传易感性有关的基因。另一种途径：是通过假定某一基因特定功能异常可能引起疾病，推断哪些基因可能与该疾病有关，一旦分离了这些所谓的候选基因并获得了适当的RFLP标记，就可开展家系研究，了解某些基因多态性是否与特定疾病的遗传分离。

二、感染性疾病的基因诊断

感染性疾病是由某种病原体侵入人体所致，这些病原体包括病毒、细菌、衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、原虫及真菌等。过去，对这些病原体的分离、鉴定，是一项费时、耗财的工作，在某些感染的早期或疾病的后期，分离、鉴定病原体难度更大，甚至不可能，特别是病毒感染、那些不易体外培养（如结核杆菌）和不能在普通实验室安全培养的病原体（如立克次体）等。随着分子生物学技术的发展，直接检测这些病原体的特异性基因成为可能。应用PCR技术检测这些病原体，具有方法简便、结果可靠、快速、对检材要求低、适应性广泛和节省费用等许多优点，因而已在感染性疾病诊断中广泛应用。核酸分子杂交技术也用于病原体的检测。此外，通过DNA芯片技术可对大多数感染性疾病做出明确的病原体诊断。基因诊断在感染性疾病中的应用主要包括以下几个方面：①快速准确地诊断出致病病原体；②用于检测带菌者和潜在性感染；③大规模的病原流行病学现场筛查工作；④对医学微生物科、属、种的准确分类鉴定；⑤培养基和无菌试剂微生物的检测；⑥病原体抗药性的快速敏感试验测定等。

三、肿瘤的基因诊断

虽然肿瘤的发病机制尚未完全明了，但人们可以初步认为肿瘤的发生是由于个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖。无论是抑癌基因发生突变还是原癌基因发生突变，如果确定这些改变的发生，都必须进行基因诊断。基因诊断除用于细胞癌变机制的研究外，还可对肿瘤进行诊断、分类分型和预后检测。目前，肿瘤基因诊断采取以下策略。

（1）检测肿瘤相关基因：如原癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因等基因的突变及表达异常。可应用基因突变及表达异常的诊断方法。在90%的胰腺癌、50%的结肠癌中有K－ras基因第12位密码子的突变，可采用PCR/ASO或PCR－SSCP法来检测其突变。

（2）检测肿瘤相关病毒的基因：①与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤有关的EB病毒；②与宫颈癌有关的人类乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）；③与肝癌有关的乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）；④与成人T细胞性白血病、淋巴瘤有关的HTLV－1等。均可采用病原体的诊断方法。

（3）检测肿瘤标志物基因或mRNA：如肺癌患者往往存在ras、myc、erb和src癌基因过度表达，因而可采用Northern杂交或RT－PCR进行mRNA水平的检测。而癌基因neu的扩增与乳腺癌患者术后复发和转移关系密切，可采用Southern杂交分析neu基因拷贝数，也可采用Northern杂交或RT－PCR进行mRNA水平的检测。

肿瘤的发病机制和治疗研究一直在不断发展中。因此，肿瘤的基因诊断方法也在不断更新和扩展，不断有新的方法出现，如利用微卫星不稳定性，直接诊断膀胱癌等和对端粒酶活性检测进行诊断等。基因诊断还用于肿瘤多药耐药性的检测。

四、基因诊断在法医学中的应用

人体的多样性和个性取决于基因组DNA核苷酸序列的差异，即DNA的多态性。运用基因诊断技术可以分析DNA多态性，极大地推动了法医生物学的发展。特别是第3代遗传标记——单核苷酸多态性（SNP）的发现，使得人类的遗传变异研究更加精细，SNP结合DNA芯片技术的方法将成为法医学鉴定中一种很有前景的新方法。人的体型、长相约与500多个基因相关，应用基因诊断技术理论上可以揭示人的外貌特征、脸型和长相等。

1.DNA指纹（DNA finger－print）　目前，发现人类微卫星DNA和小卫星DNA等是重要的人类多态性标志，针对VNTR人工合成寡核苷酸探针，与经过酶切的人基因组DNA进行Southern印迹杂交，可以得到长度不等的杂交带，而且杂交带的数目和相对分子质量大小具有个体特异性，就像人的指纹一样，因而把这种杂交带图谱称为DNA指纹。其具有以下几个特点。

（1）一个DNA指纹探针可同时检测十几个，甚至几十个位点的变异，因而DNA指纹更能反映基因组的特异性。

（2）具有高特异性，只有同卵双生子女才会有完全相同的指纹。

（3）具有稳定的遗传性，通过家系分析表明，DNA指纹谱中几乎每一条带都能在双亲之一的指纹谱中找到，而产生新带的概率仅为0.001%～0.004%。

（4）DNA指纹图谱具有体细胞稳定性，即从同一个体中不同组织、血液、肌肉、毛发及精液等产生的DNA指纹完全一样。因此，DNA指纹可作为法医鉴定的有力依据。

2.个人识别和亲子鉴定　法医鉴定的主要目的之一就是个人识别和亲子鉴定。由于DNA指纹具有高度个体特异性，除了同卵双生，目前未发现相同的DNA指纹，因此可用于个体识别（图14－5）。而DNA指纹的稳定遗传性表明，子女的DNA指纹条带来自父母双方，可以从生物学父母的基因指纹图谱中找到相应的条带。因此，DNA指纹可用于亲子鉴定（图14－6）。DNA指纹分析的主要手段是进行Southern杂交，与一般RFLP分析基本相同，再结合PCR技术，使结果更清晰、准确，更有使用价值。

图14－5　个体识别

图14－6　亲子鉴定

3.法医物证　在法医物证检测中，在一张Southern杂交图上对现场检验材料，如毛发、血液、精斑或唾液等的DNA指纹与嫌疑对象的DNA指纹进行比对，确定两者的关系。如果条带完全一致（包括条带位置和强度），则为同一个体的可能性极大。但常需采用多个探针，并通过概率计算或相关技术处理才能确定。不过需要说明的是，目前作为背景对照的DNA指纹图谱还相当有限，不能完全排除全世界60亿人中实际上不会出现完全相同的DNA指纹。因此，DNA指纹可以排除嫌疑对象，但不能单一根据DNA指纹完全确定罪犯。从图14－7中可以看出嫌疑犯A不是该案的罪犯，而嫌疑犯B则有很大的作案可能性，但还需要其他证据的支持。

图14－7　DNA指纹用于法医物证

（潘銮凤）

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