一、实验目的
1．掌握凯式定氮法测定蛋白质含量的原理和方法;
2．学会使用凯式定氮仪。
二、实验原理
以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。随后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定。根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。
三、实验试剂与仪器
(1)实验试剂:
②40%氢氧化钠溶液:称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中。
③4%硼酸溶液:称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至100mL。
④0．1mol/L盐酸标准滴定溶液:用无水碳酸钠标定。
⑤甲基红—次甲基蓝混合指示液:将次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)和甲基红乙醇溶液(1g/L)按12体积比混合。
(2)实验仪器:
①凯氏烧瓶:500mL;可调式电炉;铰肉机;组织捣碎机;粉碎机;研钵。
②蒸汽蒸馏装置:见图4－2。
图4－2 微量凯氏蒸馏装置
四、实验步骤
1．试样的制备
(1)固体样品:取有代表性的样品至少200g，用研钵捣碎、研细;不易捣碎、研细的样品应切(剪)成细粒;干固体样品用粉碎机粉碎。
(2)液体样品:取充分混匀的液体样品至少200mL。
(3)粉状样品:取有代表性的样品至少200g(如粉粒较大也应用研钵研细)，混合均匀。
(4)糊状样品:按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，混合均匀。
(5)固液体样品:按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，混合均匀。
(6)肉制品:取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g、用铰肉机至少铰两次，混合均匀。
上述试样应放入密闭玻璃容器中，于4℃冰箱内储存备用，尽快测定。
2．称样、处理
(1)固体、粉状、糊状、固液体试样:称取0．5～5g试样(使试样中含氮30～40mg)，精确至0．001g，放入凯氏烧瓶中(避免黏附在瓶壁上)。
(2)液体试样:取10～20mL试样(使试样中含氮30～40mg)移入凯氏烧杯中，蒸发多余水分。
3．消化
向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0．4g、硫酸钾10g、硫酸20mL、及数粒玻璃珠。将凯氏烧瓶斜放(45°)在电炉上，缓慢加热。待起泡停止加热，内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0．5～1h。取下凯氏烧瓶冷却至约40℃，缓慢加人适量水，摇匀。冷却至室温。
4．蒸馏
(1)常量蒸馏。
向接收瓶内加入50mL4%硼酸溶液及4滴甲基红－次甲基蓝混合指示液。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使冷凝管下口浸入硼酸溶液中。将盛有消化液的凯氏烧瓶连接在氮素球下，塑料管下端浸入消化液中。沿漏斗向凯氏烧瓶中缓慢加入70mL40%氢氧化钠溶液，使漏斗底部始终留有少量碱液，封口。加碱后烧瓶内的液体应为碱性(黑褐色)。通入蒸汽，蒸馏20min(始终保持液面沸腾)，至少收集80mL蒸馏液。降低接收瓶的位置，使冷凝管口离开液面，继续蒸馏3min。最后用少量水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内，取下接收瓶。
(2)微量蒸馏。
将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。向接收瓶内加入10mL4%硼酸溶液和1滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取10mL稀释定容后的试液，沿小玻璃杯移入反应室。并用少量水冲洗小玻璃杯，一并移入反应室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约10mL 40%氢氧化钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓慢流入反应室。随后立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽蒸馏5min。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏1min。用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。
5．滴定
用0．1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。同一试样做两次平行实验，同时做空白实验。
五、结果计算
常量蒸馏按式(1)计算:
微量蒸馏按式(2)计算:
式中:x——食品中蛋白质含量(质量百分率)，%(m/m)或(m/V);
V——滴定试样时消耗0．1mol/L盐酸标准滴定溶液的体积(mL);
V0——空白试验时消耗0．1mol/L盐酸标准滴定溶液的体积(mL);
c——盐酸标准滴定溶液的摩尔浓度(mol/L);
0．014——1mL1mol/L盐酸标准滴定溶液相当于氮的质量(g);
m——试样的质量(g);
F——氮换算为蛋白质的系数。按以下换算:
小麦5．83;小麦粉及其制品5．70;大麦、燕麦、黑麦5．83;大米5．95;花生5．46;大豆及其制品5．71;畜禽肉及其制品6．25;乳及乳制品6．38;芝麻、向日葵子、南瓜子5．40;栗、胡桃5．30;其他食品6．25。
六、注意事项
(1)本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范围为2．00～5.00g;液体样品取样10．0～25．0mL(约含氮30～40mg)。若检测液体样品，结果以g/100mL表示。
(2)消化时，若样品含糖高或含脂较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。
(3)消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。
(4)硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。
(5)在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
七、思考题
(1)蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液?加入量对测定结果有何影响?
(2)在蒸汽发生瓶中、加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸的作用是什么?若在蒸馏过程中才发现蒸汽发生瓶中的水变为黄色，是否可马上补加硫酸?
(3)实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些?
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