单倍体育种技术

水稻单倍体育种技术中育种目标确定、杂交圃建立以及杂交后代培育圃的F2、F3代材料的种植、选育步骤都与有性杂交育种技术相同，也可以使用相同材料。水稻花药培养获得加倍的稳定单株后的单株选择、品种比较试验、区域试验、生产试种示范的技术方法也与水稻有性杂交育种完全相同。水稻单倍体育种技术与有性杂交育种技术不同的是利用F2、F3代材料的花药进行离体培养获得单倍体植株，经过染色体加倍后获得基因纯合型的单株，从而培育出稳定的优良品种。

水稻野栽有性杂交育种与野栽杂交单倍体育种的技术程序差异比较见图5-1。

从图5-1可以看出，采用花药培养的单倍体育种技术，可以有效缩短野生稻与栽培稻杂交选育的年限周期，加强野生稻种质育种利用效果，提高利用者的积极性。图5-2表示单倍体育种的基因遗传原理。在有两对等位基因的情况下，杂种后代F1代的细胞减数分裂中基因重新组合，将产生4种类型的卵细胞和4种类型的精子。在常规杂交育种中自交授粉将产生16种基因型，由于存在基因互作的不同效应，会出现许多不同的表型，如果两对基因显性表达会出现9∶3∶3∶1的性状表型，这就是杂种分离现象。其中一种基因型的选择效率为1/16。如果采用单倍体育种法，通过人工接种F1代的花药，其中只有4种基因类型的花粉，所产生的单倍体植株也只有4种类型，经过染色体加倍得到的纯合二倍体也是4种类型，其中一种基因型的选择效率为1/4。可见在存在两对等位基因的情况下，常规杂交育种法和单倍体育种法的选择效率之比为1/16∶1/4，后者比前者提高了3倍。依此类推，如果杂交的两个亲本中有11对互不相同的等位基因，其F1代能产生211=2 048种不同基因型的配子（卵和精子），配子相互自由组合，在F2代将产生2 0482=4 194 304个不同基因型的个体。常规杂交育种法就需要从这大量的基因型个体中挑选出我们所需的那一个。用单倍体育种法只需要从2 048个基因型中就可以选择出所需要的个体，选择效率提高了2 000多倍。当然，这只是一种简单的数学概率推理。由于不少作物的花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率偏低，上述优越性不能充分表现出来。尽管如此，单倍体育种技术在提高选择效率上仍然具有明显作用，对于野生稻优异种质导入栽培稻种质的创新和感光型杂交水稻新品种培育都具有更深远的影响。

图5-1  自花授粉作物常规杂交育种和单倍体育种程序比较图

图5-2  单倍体育种法和常规杂交育种法遗传模式图

单倍体育种技术的关键在于杂种后代的花药培养技术环节，提高花药培养的绿苗获得效率（绿苗分化率）十分重要。其余的技术方法与有性杂交育种技术相同。

1.实验室的建立

（1）实验室

一般小型水稻（含野生稻）花药培养实验室需要9间功能各异的房间，每个房间的面积为15~20 m2，即培养室、接种室、消毒室、培养基配制室、纯净水（蒸馏水）生产室、称量室、干燥室、染色体检验室、药品与仪器储存室。如果工作量大就需要扩大培养室、接种室、消毒室、药品与仪器储存室的面积和设备规格。

（2）仪器设备

玻璃器皿：烧杯（2 000 ml、1 000 ml、500 ml、200 ml、100 ml、50 ml等各2~3个）；量筒或量杯（2 000 ml、1 000 ml、500 ml、200 ml、100 ml、50 ml等各1~2个）；移液管（0.2 ml、2 ml、5 ml、10 ml等各1~2个）；玻璃捧（3~5条）；试剂瓶（5 000 ml、2 000 ml、1 000 ml、500 ml、100 ml、50 ml、20 ml、10 ml、5 ml等，其中1 000 ml以上的2~3个，100 ml以上的5~10个，50 ml以下的10~15个）；试管（5 cm×15 cm等一批）；三角瓶（200 ml、100 m、50 ml等一批）；培养皿（15 cm、10 cm等）；培养袋（具高温消毒功能）；培养瓶（具高温消毒功能、5 cm×15 cm）；纯净水器（1~2个）；水桶（3~5个）；瓷托盘（15 cm×20 cm、20 cm×30 cm、25 cm×35 cm、10 cm×15 cm等各3~5个）；硫酸纸；滤纸；镊子（20 cm、15 cm、10 cm等）；手术剪刀（15 cm、10 cm眼科手术剪刀、普通剪刀等）；口罩；手套（防酸手套、一次性胶手套、劳保手套等）；工作服；毛巾。

电子天平（分析天平感量1∶10 000、1∶1 000两种）、干燥箱、冰箱、光温自控培养箱、纯净水器、超净工作台（2~3台）、高压消毒锅（卧式、手提式等）、试验台、櫈（座椅）；培养架（数量以留有人行道，放满培养间为限）、窗帘布（用于暗培养室）、办公桌和座椅等。

（3）药品试剂

培养基的药品购置应按照试验需要的培养基成分及各种化学试剂的种类进行（见表5-1）。此外，需要购置消毒剂（酒精、升汞、漂白粉等）及清洁剂（洗衣粉、肥皂、盐酸、浓硫酸、重铬酸钠、高锰酸钾、草酸）等物品。

2.培养基的配制

（1）花药培养基的选择

水稻杂交后代花药培养基多种多样，有适应籼稻的花药愈生组织诱导培养基、分化培养基；有适应粳稻的花药愈生组织诱导培养基、分化培养基；也有适应于普通野生稻花药培养的培养基；以及普通野生稻、野栽杂交后代花药一次培养成苗的培养基。花药培养基是水稻单倍体育种成功的关键，选择或研制出高效的诱导培养基与分化培养基，就能有效提高花药培养效率，从而提高整体单倍体育种的效率。进行花药培养的单倍体育种实验室，必须研究具有自主知识产权的高效培养基，只有掌握高效培养基配方，才能提高单倍体育种效率，提高研究水平和竞争能力。

（2）花药培养基配方

感光型杂交水稻的花药单倍体育种可先采用已经公开的花药培养基配方作为起步的基础，随后进行自己的培养基配方研究，尽快研制出自己实验室的高效培养基以解决关键技术问题。花药培养基优化配方研制最理想的研究方法是正交设计法，它能快速有效地获得适应自己试验所需的配方。表5-1是植物花药培养较常用的培养基配方。

表5-1  早期常用的花药培养基配方

续表

注：2，4-D、NAA、IAA、6-BA、KT等使用种类和含量可根据实际情况决定，在基本配方上没有明确规定。

陈成斌经过多年对普通野生稻和野栽杂交后代花药培养的研究，配出了较高效的培养基：花药愈伤组织诱导培养基YD2培养基和绿苗分化培养基YC5培养基（陈成斌， 2005）；以及随后研制成功的普通野生稻花药一次培养成苗的培养基YO培养基、野栽杂交后代一次成苗培养基YZ培养基，详见表5-2。

表5-2  普通野生稻及野栽杂交后代花药培养基本培养基（陈成斌，1986~2005）

续表

张佩莉、唐丽肖、陈成斌（1976）进行水稻花药简化培养基的研究，用了新鲜的马铃薯、绿豆、大豆、刀豆、番茄各20%的水提液替代化学药品培养基的大量元素、微量元素和有机物，结果发现，愈伤组织诱导效果最好的是刀豆培养基，其配方成分及具体做法是：刀豆（20%）洗净晾干切碎加一定的蒸馏水煮沸半小时，用两层纱布过滤。余下的渣滓用同样方法再煮一次过滤。两次滤液加在一起不超过培养基总体积的45%，然后加入铁盐（同MS）5 ml、蔗糖6%、2，4-D 2 mg/L等附加成分。愈伤组织诱导率平均为2.9%，最高组合的诱导率达7.74%，高于马铃薯培养基1倍多，在当时超过许多化学药品合成培养基。

（3）培养基的配制

由于花药培养基含有多种类型的药品（物品），在配培养基时先分类配制母液，然后利用母液配制培养基。

①母液配制：培养基母液可按以下不同成分含量进行配制。

a.大量元素母液：把无机盐类的N、P、K、Mg、Ca等大量元素成分按培养基配方的50倍浓度称量，用少量蒸馏水分别溶解后，混合配在一起。溶解不同无机盐时，需注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，按避免生成硫酸钙或磷酸钙等不溶物的顺序加入，最后用蒸馏水定容至一定体积。

b.微量元素母液：用十万分之一或万分之一的天平，把B、Zn、Mn、Cu、Co、Mo等微量元素按培养基配方的50倍浓度含量逐一称量，并依次溶解，最后混合在一起定容至一定体积。

c.有机物母液：把氨基酸与酰胺类和维生素类微量用品也按培养基配方的50倍浓度称量，逐一溶解后混合一起后定容至一定体积。

d.铁盐母液：需要单独称量配制。

e.生长素、细胞分裂素等按0.2~1.0 mg/ml的浓度单独配制母液。

f.蔗糖、琼脂在配制培养基前分别称量。

②培养基配制：每次按需要量配制培养基，配制时只需把各种母液按所需容积分别吸取，并混合在一起即可。每1升培养基的吸取量按公式计算后逐个吸取。公式为：每升培养基要求含量÷每毫升母液含量=母液吸取量。母液吸取完毕后加入蔗糖和预先以一定蒸馏水加热溶化的琼脂，定容至1升。最后用Na OH或HCl调节p H值至要求值，搅拌均匀后即可分装入试管或三角瓶。

（4）培养基消毒

分装后的培养基随即塞上棉花塞，并用牛皮纸分捆包好包头纸，用铅笔在包头纸上写上培养基的编号，然后装入铁丝框，放入热压高压锅内加热灭菌。热压消毒的时间原则是在能达到灭菌效果的条件下，用最短的时间和最低的温度最好，一般采用1.1 kg/cm2消毒15分钟。因为消毒时间过长或温度过高会引起有机物的破坏，特别是维生素类物质很容易在高温下发生分解，并且由于蔗糖的分解变酸会引起培养基p H值的变化，琼脂成分过热分解后凝固不好。把培养基消毒好并经冷却后从高压消毒锅取出，随后放入接种室备用。

3.花粉发育时期的检定

选择正确的花粉发育时期是提高花粉植株诱导率的重要因素，采集接种花药材料时应先进行花粉发育时期的检定。被子植物的花粉发育经历以下几个时期：

四分孢子：经过减数分裂以后，形成连接在一起的4个分生小孢子。

单核期：从四分孢子分开至小孢子第一次细胞分裂为止。单核期又可以分为早、中、晚3个时期。单核早期的细胞体积较小，核大，居于正中位置，细胞质中没有产生液泡。单核中期的细胞体积已经增大至正常大小，细胞质中开始出现小的液泡，但是，细胞核还没有被液泡挤压向边缘移动。单核晚期的细胞特征是液泡由小变大联合成大的液泡，并挤压细胞核，使其靠近细胞壁，核物质已经充分积累，准备开始细胞分裂，这个时期称为单核靠边期。多年来众多科学家的研究结果表明，许多植物适合接种的花粉发育时期就是这一时期。

双核期：花粉细胞进行第一次有丝分裂，在花粉外壁内形成2个互有分化的细胞，即生殖细胞和营养细胞。营养细胞的核（称营养核）较大，染色较浅，并且周围有丰富的细胞质；而生殖细胞的核（称生殖核）较为浓缩，染色较深，并且细胞核外只带有少量的细胞质。在双核期的花粉细胞内可以观察到开始有淀粉积累，一些植物中的双核后期花粉细胞内有大量的淀粉积累，这为镜检核的状况带来很多不便。随着花粉细胞的发育，生殖核成分进行复制，准备进行花粉细胞内发生的第二次有丝分裂。

三核期：生殖核分裂为2个精子，此时花粉内可看到3个核，即1个营养核和2个精子。精子的形状随着植物种类的不同而呈圆形、椭圆形、豆形甚至带状。在三核期的花粉细胞中一般有大量的淀粉积累。

检查花粉的发育时期可用压片染色的方法借助显微镜来检定。一般采用醋酸洋红压片法。先用镊子取出花药，放置在载玻片上，滴上1滴醋酸洋红染液，用解剖针在染色液中把花药压成几段并轻轻拍打，使花粉从花药囊中游离出来，剔除多余的花药囊残片，并盖上盖玻片。用解剖针钝端轻轻挤压一下，以去掉盖片下的气泡，使花粉铺开，再用吸水纸吸去被挤出盖玻片四周外的染液，置于显微镜下进行镜检。

中国科学院广东植物研究所推荐用碘和碘化钾溶液对不易被醋酸洋红染色的水稻花粉进行染色。碘和碘化钾溶液是显示淀粉的组织化学染料，对细胞核和细胞质没有染色作用，但是可以使无淀粉的单核期整个花粉染上黄色，从而利用核质的密度不同，在碘的颜色衬托下把核的轮廓明显暴露出来。但是双核期以后的花粉细胞，由于淀粉的存在而被染成蓝黑色，不易观察到细胞内核的状况。

确定花粉发育时期也可以借助镜检和植株外部形态特征相结合的方法。如水稻幼穗上小花的颖壳为白色微带浅绿色，并且被镊子捏住后容易横向撕断，而花药的位置约居于颖壳的1/2高度时，花粉多数处于单核中后期。当颖壳的颜色为较明显的浅绿色并且不易被镊子横向撕断，却易被随着脉纹纵向撕开，此时一般已经进入双核期。然而必须指出的是，外部形态指标易受品种、气候、栽培条件等各种因素的影响，因此必须用镜检进行校验。万万不可因贪图省事，不分时间、地点、品种而随便加以套用，避免由于在花粉发育时期检定上的不准确而贻误全局。

4.接种材料的消毒与接种技术

花药在接种前需要进行消毒，以防止接种时携带微生物到培养基上引起污染。花药接种材料一般是指进行消毒的整个稻穗。消毒剂是酒精、升汞、漂白粉，具体操作技术要求：先剪去接种稻穗剑叶，用70%的酒精擦穗子表面，带入接种室，并和其他接种用的酒精灯和95%的酒精、表面消毒的70%酒精、纱布、接种剪刀、镊子、接种纸、记号笔、试管架等同时放入超净工作台上，开机30分钟。然后，再用酒精擦拭一遍后，剥开叶鞘，取出穗子，整成一级枝梗的状态，用纱布包好，放入1 000 ml的内，用事前配制好的0.1%的升汞水浸泡7~10分钟，或者用饱和的漂白粉清液浸泡10~20分钟；消毒时间需要严格掌握。经过消毒后的材料用冷却的高压消毒的蒸馏水或自来水进行冲洗3~4次，除去消毒剂特别是汞离子。

花药接种方法随着植物不同和操作者的习惯不同有所差异。左手拿住野栽杂交后代或水稻杂交后代的穗子，用剪子剪去小穗颖壳的上半部，然后用镊子逐一把花药从颖壳内挑出落在接种纸上，每挑10个小穗的花药，将其装入试管内，塞好棉花塞，每接种满1个试管架就换另一试管架，或者每接好6支试管就用绳子捆扎成1捆，并用牛皮纸整捆包好棉花塞的试管头。每接种1次换1张接种纸，同时把剪刀放在酒精灯上燃烧1次，并插入70%酒精消毒瓶内消毒1次。

接种花药可以一人操作，也可以双人合作。双人合作时一人剪颖壳，取花药；一人接种花药，装入试管或三角瓶内。把花药取出集中放在接种纸上，然后倒入培养基容器内，按每一个试管接种60枚花药或每个三角瓶接种90枚花药的数量进行接种。每接种1次换1张接种纸，也可以边取花药边接种，直接投入培养基容器内。

取花药的方法也各不相同。有人用比较尖细的小镊子镊合后从颖壳侧面传入颖壳，然后稍松手指利用镊子的张开力分开颖壳，再迅速镊出花药；也有人先用剪刀齐花丝部位剪下颖壳，用镊子夹住颖壳顶部在瓶口震敲，使花药直接落入培养基面上。

接好花药后，把瓶口对着酒精灯消毒一下，迅速塞上棉花塞，并包好包头纸，每一根试管或三角瓶都要单独包上包头纸。包头纸应在使用前经过高温消毒，并在接种前和接种材料等一起拿进接种间。

5.预防污染的措施

花药培养过程中的预防污染是一项综合性的措施，包括培养基和接种工具、用品（含超净工作台）的消毒；接种者的手指消毒；接种过程中防止污染源的接触，以及培养过程中微生物污染等问题。培养基和接种材料消毒等前面已经有所介绍，此处重点介绍接种过程因操作引起的污染和培养过程的微生物污染问题。野生稻主要生长在我国南方高温高湿地区，所以需要预防污染的问题极为突出。接种过程会引起细菌性污染和真菌性污染两种污染。

接种操作引起细菌性污染主要是由接种用具引起，包括接种操作者的手指带菌。当用手指拿住穗枝梗和颖壳基部，用小剪刀剪颖壳时，由于手指消毒不彻底，通常很容易沾染接种物，特别是一手拿颖壳基部，一手用镊子剥开花器取出花药的做法，在操作不熟练的情况下更易造成污染。因此，接种前操作者必须修剪指甲，并用肥皂仔细洗手，然后再用70%的酒精棉花擦手，也可以倒酒精在手掌中然后擦手。在接种过程中，每接种完1瓶（管），需再用酒精擦拭1次手指和手掌。接种用的镊子、剪刀，都需要在酒精灯上烧灼一下，然后再放入酒精瓶内冷却后才能接触花药。有人喜欢用双镊子操作，一把烧灼一下后拿起在夹持颖花的手上冷却，另一把取花药，随后交替使用。每次用过的接种纸、培养皿、已经接种好的瓶口（管口）和棉花塞等都要在酒精灯火焰上灭菌1次。接种纸接种1次换1张，千万不要贪图节省纸而连续使用。另外，接种材料本身一定要消毒彻底，避免接种材料带菌。

接种操作过程也会带来真菌性污染，一般因接种室的空气污染造成。这种空气污染基本上是由于接种空间灭菌不彻底，放入接种室的培养瓶（试管）的棉花塞外面或者是包头纸缝间夹带孢子，在打开棉花塞时扬起所致。避免此类污染的方法是在培养容器放入超净工作台前预先去掉包头纸。习惯于不去包头纸的接种者，宜预先解除扎在包头纸上的橡皮筋或小绳子，使接种时不易扬起沾附在包头纸上的尘末，减少接种空间污染。在打开棉花塞时动作要轻，尽量减少打开棉花塞时扬起沾附在包头纸上的尘末。在打开棉花塞和接种过程时，要将瓶（管）口置于酒精灯火焰的上方进行，这样可以借助火焰上升气流避免空气中飘浮的孢子落入瓶（管）中。

在湿度较高的培养室内培养几周后常会发现培养基上出现真菌性污染，并可以检查到菌种的来源是棉花塞上生长的菌丝产生的孢子。防止的方法在于调节空气的相对湿度。也可以在接种后用饱和硫酸铜溶液浸渍一下棉花塞，任其自然干燥，但是需要防止硫酸铜溶液进入培养基中，因为铜离子浓度过高的溶液对培养物的细胞有毒害作用。棉花塞利用硫酸铜溶液处理干燥后使用，对防止真菌性污染效果较好。

6.花药培养

水稻（野生稻、野栽杂交后代）花药培养有1次培养成苗和2次培养成苗2种方法。然而不管用哪一种方法，在诱导愈伤组织阶段都需要进行暗培养，在分化绿苗阶段都需要进行光培养。

（1）暗培养

一般在25±1℃，空气湿度65%的条件静置培养，约3~5周后形成愈伤组织。

（2）光培养

在1 500 lx的荧光灯下每天照16小时，温度25±1℃，空气湿度65%的条件静置培养，直至愈伤组织分化出根、茎、叶形成幼苗。为了获得更多的绿苗，可以把已经出现绿苗的愈伤组织，再次转移到新的分化培养基进行分化培养，或者继代培养后再分化培养。

（3）炼苗移植

当绿苗长到15~20 cm时，可以移至培养室外打开盖子，放在室内炼苗3~5天；然后清洗根部的培养基至干净，注意不要损伤根系，移栽于事先准备好稻田泥浆的盆子内，夏天注意保湿，冬天注意保暖，然后移栽大田或温室内。

7.单倍体绿苗加倍

水稻（普通野生稻、野栽杂交后代）的花粉植株约有50%的植株能够自主进行染色体加倍，二倍体出现率随着愈伤组织的年龄而增高，在愈伤组织产生后30~50天再转分化的绿苗植株能结实的占80%左右，其后代没有遗传性状分离。

对不结实的植株进行染色体数目检查，采用根尖检查的方法。取根尖1.0~1.5 cm,共10~20根，用Carnoy固定液3∶1固定，用孚尔根方法染色，在显微镜下进行染色体计数。确定其单倍体数目后，采用秋水仙碱0.2%溶液或富民隆0.2%溶液对花粉植株一代（H1）中的单倍体植株进行浸根处理。秋水仙碱0.2%溶液浸泡24~48小时；富民隆0.2%溶液浸泡120小时，效果较好。

8.单株培育选择

把收获的H1代种子及其亲本分别播种育壮秧后，在选种圃内分小区插栽，亲本分别插栽在H2代小区两旁，经常观察记录其生长情况，在成熟期选择超亲的单株。选择方法与杂交育种中单株选种方法相同。

9.品比及区试

对选择出超亲的优良单株，繁殖足够种子，按杂交育种技术中品比及参加区试的技术流程和方法进行优良品系的比较试验，育成通过地方或国家区试的新品种，并申报国家新品种保护。