油橄榄离体繁殖技术的步骤

四、油橄榄离体繁殖技术的步骤

(一)植株外植体的搜集和切除

要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。应该从有良好的生长特性并生长于良好卫生条件下的植株获取，这才能保持品种的独特性和遗传稳定性。要从健壮的油橄榄树上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。将采来的油橄榄材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。

(二)外植体的消毒和培养的开始

这是茎尖繁殖技术中很重要的步骤。外植体一般在果园里，或在温室里保存母株。建议使用植物材料不能直接来自于油橄榄树林，因为这种材料含有大量的单宁酸，在体外培养时容易导致组织氧化，从而易受污染。为了减少这些问题，母株应种植在容器中，并保存在温室内。母株在成长过程中要每周喷洒杀菌剂、杀虫剂和抗生素(硫酸链霉素)来控制疾病。

油橄榄植物材料一般用次氯酸钠消毒，在不同浓度和暴露时间进行试验，以选择最有效的组合。灭菌前用自来水冲洗植物材料。为避免由于酚类氧化引起的组织褐变，培养基里需要补充抗氧化剂，如抗坏血酸(10～20ml/L)，或用含有抗氧化剂的无菌水对植物组织进行预处理30分钟。另一种避免氧化的技术是频繁的外植体继代，使基板一直不变暗。灭菌后，外植体用无菌试管盛放。

(三)培养基的配制

培养基(Medium)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。根据多年油橄榄离体繁殖试验，目前比较成功的培养基为OM培养基和PM培养基(均为改良培养基)，其成分见表8－2。

油橄榄在组织培养过程中要取得令人满意的增长，需要NO₃^－和NH₄⁺、无机氮源和谷氨酰胺。其中，钙与氮的比例是非常重要的，一般在油橄榄培养基中钙与氮比例约为1∶11。油橄榄培养基中含有营养素、微量营养素、维生素和氨基酸。其中，蔗糖或甘露醇被作为碳源。甘露醇在30g/L，琼脂浓度为0.5%～0.8%时被证明能使油橄榄芽有效地增殖。介质的pH值要调整到5.7～5.8，20分钟后才能进行121℃高压灭菌。在OM中还含有植物生长调节剂，使油橄榄芽增殖的最佳分裂素：依据品种的不同，玉米素浓度从0.5～4.0ml/L不等。其他细胞分裂素，如6－(γ，γ－二甲基烯丙基氨基)嘌呤核苷或6－苄氨基嘌呤，都不能有效地使橄榄芽增殖，使用这些激素往往会产生很短、薄的芽。

表8－2　油橄榄培养基成分表

(四)芽的生长和生根

1.芽的生长

由增殖所产生的芽很短，不能为生根阶段做准备。将外植体转移到另外一种培养基中，能够促进短芽伸长，类似之前的步骤，但含有赤霉素(20～40mg/L)。当植株获得适当的长度(4～5个节点)，它们就为生根阶段做好了准备。增殖所使用的基质由品种决定，表8－3给出不同品种的适当的培养基。

表8－3　不同油橄榄品种的繁殖

续表8－3

2.生　根

通过减少芽增殖阶段所使用培养基浓度的1/3或者1/4能够促进生根。使基质保存在黑暗状态下，或者加入1mg/L的IBA或NAA，能够促进生根。

(五)植株的炼苗和移栽

试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。油橄榄苗应种植在含有珍珠岩、蛭石和泥炭等容易排水基质的容器中，其中珍珠岩、蛭石或泥炭理想的比例应为1∶1∶1。为了避免植株污染，应再加上基板，每隔1周应喷1次杀菌剂。另一种方法是单独使用无机基材，如珍珠岩或蛭石，水中含有低浓度的X L－60化肥。苗盆移栽后，用透明塑料薄膜覆盖，使生长环境内保持足够的湿度和温度。同时，为了避免空间过热，应该控制温度或适当遮阴，慢慢地通过减少塑料膜的覆盖来降低空气湿度。经过炼苗，油橄榄植株要在圃地中生长1年，直到有足够的适应能力之后才能移植到油橄榄园中进行栽种。