多态性及组织表达分析

圆斑星鲽MHCⅡB基因结构、多态性及组织表达分析

圆斑星鲽MHCⅡB基因结构、多态性及组织表达分析⁽¹⁾

李宏俊1　王　娟1，2　高祥刚1　苏　浩1　刑　坤3傅立元1，2　赫崇波1

（1．辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，辽宁大连116023；

2．辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连，116029；

3．大连海洋大学海洋工程学院，辽宁大连116023）

摘　要　通过表达序列标签法和cDNA末端快速扩增（RACE）技术，分离和克隆了圆斑星鲽（Verasper variegatus）主要组织相容性复合体（MHC）ⅡB的全长cDNA序列，该cDNA全长为1　144bp，5′UTR（untranslated region）为7bp，3′UTR为450bp，开放阅读框（ORF）长度为687 bp，可编码228个氨基酸，包含信号肽、抗原结合域（β1）、IGC区（β2）、跨膜区和胞质区5个结构域。同源分析表明，圆斑星鲽MHCⅡB氨基酸序列与其他硬骨鱼具有49%～79%的同源性，与鼠、人、红原鸡和护士鲨的相似性较低，分别为34%、33%、31%和30%。圆斑星鲽MHCⅡB基因含有5个内含子，与其他硬骨鱼不同，其β2结构域编码区内存在1个109bp的内含子。根据获得的MHCⅡB基因组序列设计特异性引物，在10尾野生圆斑星鲽中扩增了包括完整内含子1和外显子2的长度约388bp的DNA片段，PCR产物直接测序后发现在270bp的抗原结合域中共有23个位点发生变异，密码子第1位和第2位的变异明显高于第3位。利用荧光定量PCR分析组织表达发现，MHCⅡB基因在健康圆斑星鲽9种组织中均有表达，但表达量存在差异，肾的表达量最高，肌肉的表达量最低，肾、心、脾脏和鳃的表达量显著高于肝、皮肤、脑、血和肌肉。本研究旨在为MHC基因家族的遗传进化分析、结构与功能的解析提供基础，同时为圆斑星鲽的分子免疫学和标记辅助育种研究提供参考依据。

关键词　圆斑星鲽；MHCⅡB；cDNA；基因结构；多态性；组织特性表达

主要组织相容性复合体（Major Histocompati－bility Complex，MHC）是在脊椎动物体内发现的参与机体免疫的高度多态基因群，其表达产物分布于各种细胞的表面，直接参与抵抗病原体入侵、免疫应答和保持自身稳定的过程［1］。MHCⅡ类基因的主要功能是编码识别各种外来抗原的细胞表面转膜蛋白，并将其呈递给CD4＋辅助T细胞，激发针对病原生物特异的免疫反应［2］。MHC基因最为突出的特点是高多态性，在群体内存在大量具有一定频率的等位基因，而且等位基因之间具有高度的核苷酸多样性［3］。不同个体间MHC遗传背景的差异将导致个体对疾病的抗性和易感性的差异，因此，MHC作为抗病的候选基因被广泛应用于动物的遗传育种研究中［4－6］。鱼类MHC基因的研究开始于1990年，Hashimoto等［7］通过同源克隆的方法扩增出鲤鱼MHCⅠ的部分序列，目前已有斑马鱼（Danio rerio）^［8］、条纹鲈（Morone saxatilis）^［9］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）^［10］、真鲷（Pagrus major）^［11］和半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）^［2］等30多种鱼类MHC的报道，鱼类MHC结构和功能的研究已取得重要进展。

圆斑星鲽（Verasper variegatus）隶属于鲽形目、鲽科、星鲽属，俗称花斑宝、花瓶鱼等，属于冷温性大型底栖鱼类。其肉质细嫩鲜美，富含多种维生素、微量元素，营养丰富［12］，主要分布于中国的黄海、渤海、东海，日本中部以南和韩国西南部的沿海海域，是非常适合中国北方沿海养殖的珍贵海水鱼类。目前，国内学者已经开展了圆斑星鲽的生物学［13］、养殖技术［14－15］和线粒体基因组［16］等方面的研究，但是关于圆斑星鲽抗病机制的研究未见报道。本研究通过大规模EST测序结合RACE技术获得了圆斑星鲽MHCⅡB的全长cDNA序列，并且通过特异性PCR扩增获得了内含子序列，以期为MHC基因家族的遗传进化分析、结构与功能的解析提供基础，同时为圆斑星鲽的分子免疫学和标记辅助育种研究提供重要参考依据。