植物病原线虫检疫检验方法与技术

第四节　植物病原线虫检疫检验方法与技术

线虫也称蠕虫。已报道的植物寄生线虫有260多个属，近6000种。植物病原线虫一般为两端尖细的线形，长0.3～1mm，有的可达10mm。多数为雌雄同型，少数为雌雄异型，有些种的雌虫可膨大成梨形或柠檬形（图7-9）。所有已知植物病原线虫都具有口针，可刺入寄主组织内吸取营养。植物寄生线虫保持水生习性，需在适当的水中、或表面有水膜的土壤颗粒上正常活动或存活，或在寄主植物的活细胞和组织内寄生。可以休眠状态（卵、胞囊）在植物体外长期存活。

植物寄生线虫可以在寄主植物的各个部位寄生，其中植物的地下部位最容易受到线虫的侵染。与其他病原物一样，植物寄生线虫有一定的寄主专化性，每种线虫只在一定范围的寄主植物上取食。不同的线虫寄主范围有较大的差异，有的线虫寄主范围非常广泛，可在许多种植物上寄生，而有的则仅在少数几种植物上寄生，且有的线虫还存在致病性的分化。

图7-9　线虫

线虫除自身的短距离移动外，主要是通过种苗调运、灌溉水及耕作农具的携带等远距离传播。其中可通过种子传播的有粒线虫属（Anguina）、茎线虫属（Ditylenchus）、滑刃线虫属（Aphelenchoides）和异皮线虫属（Heterodera）。这些线虫存在于种子内或存在于与种子混杂一起的植物残体中，有的是通过种瘿或带有胞囊的土壤混在种子中。

有的植物寄生线虫还是植物病毒的重要传播介体。这类线虫主要包括在下列三个属中：长针线虫属（Longidorus）、剑线虫属（Xiphinema）和毛刺线虫属（Trichodorus）。这些线虫多在植物根部取食，通过在病株上穿刺取食后再到健株取食，将病毒传到健康植株上。如标准剑线虫（X.index）是葡萄扇叶病毒的重要传播介体，美洲剑线虫（X.americnnum）能传播烟草环斑病毒和番茄环斑病毒，长针线虫和毛刺线虫可传播烟草环斑病毒、番茄黑环病毒和树莓环斑病毒等。因此对这些线虫的检疫意义不仅在于其本身的危害，更重要的是它们作为介体可以携带和传播危险性病毒。

关于线虫的检验鉴定方法与技术，国内外已有大量研究。在检疫检验中关键是要采用适当的方法把线虫从待检材料中分离出来，并通过形态鉴定和其他鉴定技术相结合，与近似种区别开来，以做到快速准确鉴定。

一、植物寄生线虫的分离方法

常用的分离法主要是依据线虫在水中的活动性和密度大于水的特性。当将待检的植物材料适当破碎后，在适当的温度（分离时室内温度最好保持在20～25℃左右）条件下放入水中浸泡一定时间，线虫通过自身的活动到达水中，并沉入水底部，收集浸泡液离心浓缩后在显微镜下观察线虫形态进行鉴定。也有的线虫在植物上危害，生长发育成熟后形成胞囊，干燥的线虫胞囊比重较水轻，能漂浮在水面，因此对该类线虫可采用漂浮的方法进行分离。

线虫分离的方法经过不断改进，目前已有多种方法在检疫中得到应用，以下介绍几种常用方法。

1.漏斗法

适于分离少量植物材料中有活动能力的线虫。其基本装置包括漏斗架、漏斗、乳胶管和止水夹。分离时将10～15cm直径的漏斗固定在支架上，下端连接一段乳胶管，管的近末端用止水夹夹紧。将待分离的样品剪成小块，用纱布包好，放入盛有水的漏斗中，水的深度以淹没分离材料为准。分离土壤中的线虫时，在漏斗内加一只不锈钢或塑料的网，将纱布铺在筛网上，再放土样。由于线虫自身的重量和趋水性，可以不断从植物组织或土壤中游离出来，到达水中并沉降到漏斗末端的乳胶管中。24h后小心打开乳胶管的止水夹，用小培养皿或离心管接取约5ml的水样，通过低速离心浓缩至更小体积或直接在体视显微镜下观察线虫的有无和形态。此法也称改良贝尔曼漏斗法。

2.浅盘分离法

其基本装置由两只直径不同的浅盘组成，其中上盘的底部为10目的筛网，即为筛盘。使用时，将两只直径不同的浅盘套放，将线虫滤纸或纱布平放在上盘的筛网上，用水湿润，再将待分离材料剪成小块放在其上，从两盘的夹缝注水，以水淹没样品为宜。在室温下放置12～24h后，收集下盘中的水，离心浓缩或分别通过40目和500目的标准筛，将500目筛上的残留物转至小培养皿中镜检观察。

在松材线虫的检验中，有人对以上方法进一步作了改进，其装置是用一较大的类似于贝尔曼漏斗的玻璃器皿作为外壳，取代浅盘法的下盘，其下端连一胶皮管，并通过止水夹控制水的流出。分离时采用与浅盘法相同的方法，将待分离材料放在上部的筛盘上，并从其下部缝隙将水注入分离器，室温下12～24h后收集约5ml的水样，通过低速离心浓缩至更小体积或直接在体视显微镜下观察。

3.芬威克（Fenwick）漂浮分离法

本法适合于分离土壤中的各种胞囊线虫。芬威克装置中有上筛、漏斗和具有排污孔及环颈水槽的漂浮筒。使用时先堵好排污孔，将漂浮筒注满水，将风干的土样经粗筛过筛后，放在上筛中（16目），并用水流冲洗土样。进入漂浮器的胞囊和混在土中的草屑等漂在水面，并经水槽流到60目的底筛中。用水将底筛上的胞囊冲洗到瓶内，静置一段时间后，胞囊即浮于水面，然后将漂浮物转到滤纸上晾干，在双目解剖镜下观察。

4.改进的浮力离心法

这种方法可以分离到土壤中的线虫胞囊和幼虫。每次检验的土壤样一般少于100g。如在甜菜胞囊线虫的检验中，其分离步骤为，土壤样品搓碎混匀后，倒入盛有70ml水的100ml离心管中，充分振动悬浮，然后3000r/min离心5min，去上清；将沉淀中加入80％蔗糖60ml，再充分振动悬浮，2000r/min离心2min，上清倒入套筛（20目+100目+500目），用水充分冲洗，收集100目筛中的胞囊和500目筛中的残留物，在体视显微镜下观察。

5.过筛分离法

也称套筛法，本法用于从大量土壤中分离各类线虫，包括胞囊和幼虫。分离时，选用不同孔径的筛子4～5个，筛子的孔径选择依检测目标而异，如在分离甜菜胞囊线虫时可用20目、60目、100目、300目和500目筛。将充分混匀的土壤样品置于不锈钢盆或塑料盆中，加水搅拌成悬浮状，将土壤悬浮液倒入套筛中，用清水冲洗，然后可从60目和100目筛上收集胞囊，从300目和500目筛中收集幼虫镜检鉴定。

二、植物寄生线虫形态鉴定

形态鉴定主要依据线虫侧尾腺的有无，雌虫和雄虫的头部、食道、腹部及尾部的外部形态特征和消化道、生殖系统等内部结构。植物寄生线虫的尾部形态变化多样，特别是生殖器及周围的细微结构，是线虫鉴定的重要依据。线虫的食道类型也是很重要的分类和鉴定依据。植物寄生线虫的食道多数为垫刃型，此外还有滑刃型、环型、矛型和小杆型。此外，线虫的体长、体宽及体长与体宽之比，身体各个有关体段的长度及其比例等也是有些线虫鉴定的依据。有关线虫的分类系统，请参阅有关线虫分类书籍。

三、线虫的诱集检测

厦门大学发明一种“松材线虫检测管”，该检测管是根据线虫头部化学感受器接收微生物分泌生化信息的原理，使松树中的线虫被盘多毛（Pestalotia sp）等特定的微生物引诱出来而实现早期诊断。其特点是，只需在树上钻一个直径10mm的小孔，然后插入检测管，1～4d内拔出检测管，通过检视管壁就可知该株松树有无线虫，从而便于及早发现松材线虫（Butrsa phelenchus Xylophilus），而且不伤及树皮，也无需采集大量样品回实验室检测，极大地减轻了检疫检验人员的工作量。在应用过程中，将检测管拔出后若在25～28℃下培养2～3d，还可使线虫数量增加，检查更方便。这种方法尤其适合产地检疫检验。

线虫的鉴定除采用以上方法外，近些年来随着生物技术的快速发展，有的植物线虫部分基因组核苷酸序列已测定，因此可以设计特定引物，采用分子生物学中常规PCR技术对特定线虫进行快速准确的鉴定。

四、线虫标本的制作与保存

在检疫检验中，线虫除通过活体镜检观察其形态外，有时受条件或技术的限制，不能很快作出结论，需送专门的技术中心进行鉴定，这就需要通过固定和染色，制作成半永久或永久玻片标本用作进一步鉴定。现将标本制作步骤简介如下。

（1）杀死一般采用加热的方法，即在玻片上加一滴水，放上线虫样品，在酒精灯火焰上方过火几次，约加热5s左右即可。

（2）固定可用的固定液种类很多，包括碘液、福尔马林冰醋酸固定液（FA）、福尔马林冰乙酸酒精固定液（FAA）、三羟基乙胺福尔马林固定液和布因（Bouin）固定液等，可根据具体条件进行选择。

（3）脱水采用甘油酒精快速脱水法。即将经FA固定的线虫放入盛有0.5ml脱水液（每100ml，含95％乙醇20ml、甘油1ml、蒸馏水79ml）的玻皿中，然后将玻皿放在酒精蒸汽饱和的密闭容器中，在35～40℃恒温箱中经12h后可除去标本中的大部分水，吸去上层溶液，立即加入甘油酒精混合液（7∶3），置40℃恒温箱中，酒精完全挥发后，将线虫移入纯甘油中。这样脱水的线虫可以制成永久玻片，标本长期保存。此外，还可采用乳酸甘油脱水法和甘油脱水法等。

（4）染色观察植物体内线虫时，染色可将植物组织和线虫染成不同的颜色而容易区分。对游离的线虫染色，可将内部器官染成不同的颜色而便于观察。对植物组织内部线虫、已固定的线虫和活体线虫可采用不同的染色方法，具体操作方法可参阅方中达编著的《植病研究方法》。

（5）制片可采用常规的植物病理学研究中的方法进行制片和封片。