粪便寄生虫检验技术

第一节　粪便寄生虫检验技术

由于大多数寄生虫病的症状缺少特异性，因此仅仅依靠临床症状，很难对动物寄生虫病作出肯定的诊断，在很大的程度上依赖于实验室的检查。用实验室检查方法在被检动物的粪、尿、血液中寻找虫卵、幼虫、虫体或虫体碎片，并根据对所发现的虫卵等进行鉴定以作出正确诊断。

值得注意的是，一个正确的诊断，必须对患病动物的全身情况有全面的、综合的分析和考虑。实验室检查时，虫卵等的发现，只能说明该受检动物体内已有某种寄生虫的寄生，但它是否是受检动物呈现疾病的主要原因，则还需要根据对本病的流行病学、症状、病理等各方面作综合的分析判断。此外，对一些寄生虫所引起的疾病和一些用虫卵或幼虫检查法检出率比较低的寄生虫病，在诊断时还可采用一些免疫诊断方法，但此类方法，尚在发展阶段，正在不断地改进和充实中。

寄生蠕虫大部分寄生于动物的消化道，它们的卵、幼虫和某些虫体或虫体断片通常与粪便一同排出，因此，粪便检查法是诊断这类蠕虫病的主要方法。此外与消化道相连的器官（如肝、胰）中的寄生虫，其所产出的虫卵也随粪便排出体外。呼吸道寄生虫，其虫卵或幼虫随痰液排出，在痰液进入口腔后，多数又被咽下，因此也可以在其粪便中查见其虫卵或幼虫。在禽类，泌尿生殖器官内的寄生虫所排出的虫卵同样出现在粪便中。

一、粪便样品的采集

粪便检查必须采用新鲜粪便，因为陈旧粪便往往干燥、腐败或被污染，影响正确的诊断。在必要时，对大动物可进行直肠内直接采粪；对一般动物可进行清水灌肠采样。采集的粪样需装入洁净的大口瓶内，其容量大动物至少为100g。如果缺少大口瓶，也可用洁净油纸包装，于数小时内进行检查。

对草食动物的采粪量必须多于肉食动物。采样时为求代表性，必须同时采取粪便的内外层。如果粪样不能当日进行检查，则应放在普通冰箱内或阴冷处，以抑制虫卵和幼虫的发育和防止粪便的发酵。如需转送他处检查时，则可将粪样浸入5%～10%的福尔马林中，将病原体固定，使其丧失活力。

二、粪便样品的检查方法

（一）虫体检查法

1.检查对象　用于自然或使用驱虫药等而排出体外的蛔虫类、绦虫类节片和蛲虫等的检查。

2.检查方法　粪便中的绦虫节片和虫体，其中较大型者，很易发现。对较小的，应先将粪便收集于盆（或桶）内，加入5～10倍的清水，搅拌均匀，静置待自然沉淀，而后将上层液体倾去，重新加入清水，搅拌沉淀；反复操作，直到上层液体清澈为止；最后将上层液倾去，取沉渣置大玻璃皿内，先后在白色背景和黑色背景上，以肉眼或借助于放大镜寻找虫体，有所发现时，用铁针或毛笔将虫体挑出供进一步检查。

（二）虫卵检查法

1.直接涂片检查法　此法最简便和最常用。

（1）检查对象：用于产卵较多的蠕虫（如蛔虫、捻转胃虫、毛圆线虫等）和球虫卵囊的检查。但检查时因被检查的粪便数量少，检出率较低，即当体内寄生虫数量不多而粪便中虫卵少时，有时不能查出虫卵；对于轻度感染者不能检出；不适于含有粗大夹杂物的草食动物的粪便的检查。

（2）检查方法：在洁净的载玻片上滴1～2滴清水或甘油和水的等量混合液。用牙签或火柴棍挑取少量粪便（约火柴头大小）加入水中，混匀，除去较大的或过多的粪渣，最后使玻片上留有一层均匀的粪液（其浓度要求是将此玻片放于报纸上，能通过粪便液膜模糊地辨认其下的字迹为合适）。在粪膜上覆以盖玻片，但不应产生气泡。将玻片置于低倍镜（80～100倍）显微镜下检查，必要时需用高倍镜（400倍）来确定。检查时应按顺序查遍盖玻片下的所有部分。

2.集卵法　其原则是利用各种方法，将分散在粪便中的虫卵集中起来进行检查，以提高检出率。常采用的方法如下。

（1）自然沉淀法：采用比重小于虫卵、卵囊、包囊的液体（一般用水）作为介质，使比重较小的杂物漂浮分离，虫卵则沉淀集中。

①检查对象：一般适用于检查比重较大的吸虫卵、裂头绦虫卵等。

②检查方法：取粪便约5g，加清水100ml以上，搅匀成粪液，通过40～60目铜筛过滤，滤液收集于三角烧瓶或烧杯中，静置沉淀20～40min，倾去上层液，保留沉渣，再加水混匀，再沉淀，如此反复操作直到上层液体透明后，吸取沉渣于载玻片上镜检。

（2）离心沉淀法：采用离心法使虫卵沉淀集中，可缩短操作时间。但由于本法使用粪量少，故只适用于小动物的粪便检查。

①检查对象：同自然沉淀法。

②检查方法：取混合粪便2～3g，加约10倍量的清水，通过筛子或纱布滤入小试管（或离心管）中，以1500～2500r/min离心1～2min，弃上清液，再加清水混合、离心，直至上层液透明为止，弃上清液，取沉淀物置于载玻片上镜检。

（3）自然漂浮法：采用比重大于虫卵、幼虫、卵囊、包囊的液体，使其漂浮集中于液面，与比重较大的夹杂物分离。根据情况可选择下列方法之一。

①取粪便10g，加饱和食盐水100ml，混合，通过60目铜筛，滤入烧杯中，静置30min，则虫卵上浮；用直径5～10mm的铁丝圈，与液面平行接触以蘸取表面液膜，抖落于载玻片上检查。

②取粪便1g，加饱和食盐水10ml，混匀，筛滤，滤液注入试管中，补加饱和盐水溶液使试管充满，上覆以盖玻片，并使液体与盖玻片接触，其间不留气泡，直立30min后，取下盖玻片，覆于载玻片上检查。

（4）离心漂浮法：先用漂浮法将虫卵和比虫卵轻的物质漂浮起来，再用离心沉淀法将比虫卵重的物质沉下去；或是先用离心法使虫卵及比虫卵重的物质沉下去，再用漂浮法使虫卵浮起来，以获得更高的检出率。常用的有以下方法。

①硝酸钠法：取5～10g粪便加10倍量清水搅匀，置离心管中离心沉淀2～3min，弃去上浮液，留沉淀物，加饱和硝酸钠溶液至管口，静置30min后，管口上覆盖玻片使与液面接触后，迅即取下置载玻片上镜检。

②硫酸锌法：取粪便5g，加20m1温水逐渐稀释，用铜筛过滤，稀释液分装于2支15ml离心管中，以2500r/min离心沉淀1min，倒去上浮液，再加水离心，重复3～4次直至上层液澄清为止。弃上层液，加入33%硫酸锌3～4ml，搅拌均匀，再加满至近管口，然后经离心1min后取出，用铁丝圈挑取表层液膜于载玻片上镜检。

③分层离心法：利用不同浓度糖溶液分层离心以分离线虫卵。将200g粪便加水捣碎后，经20目或40目铜筛过滤，除去粗渣，滤液盛于圆桶内存放冰箱中，沉淀2～6h，弃去上层液，将沉渣保存于冰箱内备用。再以500g/360ml、比重1.275（16℃）标准蔗糖溶液配制成1∶2、1∶4、1∶6、及1∶8四种稀释度，使冷却至接近冰点。然后，将上述不同浓度的蔗糖液按l∶2的8ml、1∶4的10ml、1∶6的6ml及1∶8的6ml的次序徐徐分层加入50ml的离心管中，而后再加入上述粪渣混悬液15ml，以2500～3000r/min离心沉淀20min，虫卵经离心后，不同比重的虫卵浓集在一定部位的液层中。最后用毛细吸管分层吸出沉淀、镜检。

（5）锦纶筛兜集卵法：取粪便5～10g，加水搅匀，先通过40或60目的铜丝筛过滤，滤液再通过260目锦纶筛兜过滤，并在锦纶筛兜中继续加水冲洗，直到洗出液体清澈透明为止；而后挑取兜内粪渣或做抹片检查。此法适用于宽度大于60μm的虫卵，通过以上处理，粗大粪渣被铜筛扣留，纤细粪渣（直径小于40μm）和可溶性色素均被冲洗走而使虫卵集中。

（三）幼虫检查法

有些寄生虫（如网尾科线虫），其虫卵在新排出的粪便中已变为幼虫；类圆属线虫的卵随粪便排出后，在外界温度较高时，经5～12h后，即孵出幼虫。对粪便中幼虫的检查可用直接抹片或其他虫卵检查法，常用的有以下方法。

（1）漏斗幼虫分离法：亦称贝尔曼氏法（Baermann’s technique）。其装置是由玻璃漏斗下接橡皮管，以夹子将管子加紧（或橡皮管下接一小试管），并装于漏斗架上，将铜丝筛放在漏斗内。取粪便（不必捣碎）15～20g放在两层纱布内，置于漏斗的铜丝筛上（可将金属筛布剪成圆片，放于漏斗中），于漏斗的边缘加入40℃～45℃的温水至淹没粪球为止，静置1～3h。此时大部分幼虫游走于水中，并沉于橡皮管内，将夹子打开，自漏斗中放出50ml水以检查幼虫（或沉于试管底部，拔取底部小试管，取其沉渣，在显微镜下检查）。

（2）平皿法：特别适用于球状粪便，取粪球3～10个，放于培氏皿或表面玻璃上，加少量40℃温水。10～15min后，取出粪球，将留下的液体在低倍镜下检查。

用以上两种方法检查时，可见到运动活泼的幼虫，如欲致其死亡以便较详细的观察，可在有幼虫的载玻片上，滴加鲁格尔氏碘液，则幼虫很快死去，并染成棕黄色。

（四）培养检查法

1.线虫蚴培养法　圆线虫目所属线虫种类很多，其虫卵在形态上又很相似，很难区别。有时为了区别这些线虫的种类，常将含有虫卵的粪便加以培养，待其中虫卵发育成为幼虫时，再检查幼虫，根据幼虫形态上的差异，加以鉴别。

常用的方法是：在培养皿底部加草纸或滤纸一张，而后将欲培养的粪便加水调成硬糊状，塑成半球形，放于皿内的纸上，并使半球形粪球的顶部略高出平皿边沿，加盖时与皿盖相接触。将此皿置25℃温箱中，注意保持皿内湿度（应使底部的垫纸保持潮湿状态）。经7d后，多数虫卵即可发育成第三期幼虫，并集中于皿盖上的水滴中。将幼虫吸出置载玻片上，在显微镜下检查。

2.球虫卵囊培养法　有时为了区别不同种的球虫，需通过观察孢子形成后的卵囊来区别。其方法是：可将浓集后的卵囊加2.5%的重铬酸钾溶液，在25℃温箱中培育，待其孢子形成后，在显微镜下检查。

（五）毛蚴孵化法

毛蚴孵化法为诊断分体吸虫病特用的方法。在诊断日本分体吸虫病时，诊断工作应在春、夏、秋各季进行，为了提高诊断的可靠性，应采用三粪六检（即每头牛采粪3次，每次粪样检查2次）。

1.用水准备　洗粪和孵化用水应选取未经工业废水或化肥、农药污染的，pH6.8～7.2的水。河水、池水、井水常含有大量水虫，水质较浑，使用前应先杀水虫（加温至60℃以上或加漂白粉后待其放出余氯）与澄清（每百千克水中加明矾6～10g）。

2.洗粪　取新鲜牛粪100g，置500ml容器内，加水调成糊状，通过40～60目铜筛过滤，收集滤液。可将以上滤液倒入260目锦纶筛兜内，加水充分淘洗，直到滤出液变清为止，而后将兜内粪渣供孵化用。在没有锦纶筛兜时，可将以上滤液收集于500～1000ml的量杯中，加水，静置20min，待粪渣和虫卵下沉后，倾去上层液，再换入清水；此后每隔15min换水一次，直到水清澈为止。当水温在15℃以上时，第一次换水后，应改用1.0%的食盐水洗粪，当水温在18℃以上时，全部洗粪和沉淀用水均应改用1.0%的食盐水，以抑制毛蚴过早孵出。

3.孵化　将粪渣倾入500ml三角烧瓶内，加入温水（不可用盐水）进行孵化。孵化时外界温度以22℃～26℃为宜，室温在20℃以上时，即无需加温。孵化时应有一定的光线。样品进行孵化后，经1、3、5h各观察1次，检查有无毛蚴在瓶内出现。毛蚴为灰白色，折光性强的棱形小虫，多在距水面下4cm以内的水中作水平的或略斜向的直线运动。应在光线明亮处、衬以黑色背景，用肉眼观察，必要时可借助于放大镜。观察时应与水虫区别：毛蚴大小较一致，水虫则大小不一，一般略大于毛蚴；显微镜下观察，毛蚴呈前宽后狭的三角形，前端有一突起，水虫多呈鞋底状。

除以上在三角烧瓶中进行孵化的方法外，有时采用顶管法或试管倒插法，也能收到良好的效果。

（六）蛲虫卵检查法

为诊断马蛲虫（尖尾线虫），用牛角药匙蘸取50%甘油水溶液，而后轻刮肛门周围、尾底和会阴部分的表面，将刮下物直接涂布于载玻片上，即可供检查。