血液寄生虫检验技术

第二节　血液寄生虫检验技术

当动物患有原虫病或丝虫病时，在动物体末梢的血液中均可检出原虫和丝虫幼虫（微丝蚴）。这些病的诊断依靠血液中原虫和丝虫幼虫的发现。

一、检查方法

用消过毒的针头自动物耳静脉或颈静脉采取血。血液采取后的检查方法有以下几种。

1.鲜血压滴检查　将采出的血液，滴在洁净的载玻片上，加等量的生理盐水与之混合，覆以盖玻片，立即放显微镜下用低倍镜检查，发现有运动的可疑虫体时，可再换高倍镜检查。冬季室温过低，应先将玻片在酒精灯上或火炉旁略加温，以保持虫体的活力。由于虫体未染色，检查时应使视野中的光线弱些。本法适用于检查伊氏锥虫和丝虫。

2.涂片染色检查　采血后，滴于载玻片一端，按常规推成血片并干燥。滴甲醇2～3滴于血膜上，使其固定，而后用姬氏或瑞氏液染色。染色后用油镜检查。本法适用于各种血液原虫和丝虫。

3.厚血膜检查　采血一大滴，在载玻片上稍加涂布，待其自然干燥，结成一层厚血膜；而后将此玻片反转，血膜面向下，斜浸入一小杯蒸馏水中，待其完全溶血；取出、晾干、再浸入甲醇中固定10min，取出，干后保存待检。如欲检查血中微丝蚴，可以苏木素－伊红染色法、明矾苏木素染色法；如欲检查血内原虫，则用瑞氏染色法或姬姆萨染色法为佳。

4.虫体浓集法　上述方法虽然可以查到血液中的原虫和微丝蚴，但血液中的虫体较少时，则不易查出虫体。为此，常先进行集虫，再行制片检查。其操作过程是：在离心管中加2%的柠檬酸钠生理盐水3～4ml，再加病畜血液6～7ml，混匀后，以500r/min离心5min，使其中大部分红细胞沉降；而后将含有少量红细胞、白细胞和虫体的上层血浆用吸管移入另一离心管中，并补加一些生理盐水，将此管以2500r/min离心10min，可得到沉淀物。取此沉淀物制成抹片，然后染色检查。

5.溶血检查法　如血中幼虫很少，可采血于离心管中，加入5%醋酸溶液以溶血。待溶血完成后，离心并吸取沉渣检查。

二、常用染色方法

（一）姬姆萨染色法

1.染色液的配制

（1）姬姆萨染色原液：取市售姬姆萨染色粉0.5g，中性纯甘油25.0ml，无水中性甲醇25.0ml，先将姬姆萨染色粉置研钵中，加少量甘油充分研磨，再加、再磨，直到甘油全部加完为止。将其倒入60～100ml的棕色小口试剂瓶中；在研钵中加少量甲醇以冲洗甘油染液，冲洗液仍倾入上述瓶中，再加、再洗、再倾入，直至25ml甲醇全部用完为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，而后将瓶置于65℃温箱中24h或室温内3～5d，并不时摇动，此即为原液。

（2）缓冲液和缓冲蒸馏水：为了保证染色效果，必须用缓冲蒸馏水来稀释染色原液，且冲洗血片时亦最好用缓冲蒸馏水。

缓冲液的配制。

甲液：磷酸氢二钠（无水）9.5g　 蒸馏水1000ml

乙液：磷酸二氢钾（无水）9.07g　蒸馏水1000ml

将甲、乙两液分别保存于塞紧的玻璃瓶中。

缓冲蒸馏水的配制：稀释染液和冲洗血片所用的蒸馏水，以pH7.0～7.2最为适宜，可按表9-1配制。已加缓冲液的蒸馏水的pH值，可用石蕊试纸测定。每次应用时宜新鲜配制，保存l周以上的不宜使用。

表9-1　缓冲蒸馏水的配制　　　　　单位：ml

2.染色法

染色时将原液2.0ml加到缓冲蒸馏水100ml中，即为染液。染液加于血膜上染色30min，后用水洗2～5min，晾干，镜检。

3.结果

（1）锥虫：细胞质呈浅蓝色，大核呈紫红或深红色，小核（包括毛基体和副基体）为小棍形而染成紫色或红色。

（2）焦虫：细胞质呈蓝色，核的染色质呈紫红色。

（3）微丝蚴：虫体清晰呈紫红色。

（4）其他：红细胞呈浅红色，嗜酸性白细胞的颗粒呈红色，淋巴细胞呈蓝色，各种白细胞的核和嗜碱性白细胞的颗粒呈蓝紫色。

（二）瑞氏染色法

1.染色液的配制　以市售的瑞氏染色粉0.2g，置棕色小口试剂瓶中，加入无水中性甲醇100ml，）加塞，置室温内，每日摇4～5min，1周后可用。如需急用，可将染色粉0.2g，置研钵中，加中性甘油3.0ml，充分研匀，然后以100ml甲醇分次冲洗研钵，冲洗液均倒入瓶内，摇匀即成。

2.染色法　染色时，血片不必预先固定，可将染液5～8滴直接加到未固定的血膜上，静置2min（固定），其后加等量蒸馏水于染液上，摇匀，过3～5min（染色）后，流水冲洗，晾干，镜检。

3.结果　基本与姬姆萨染色法相同。

（三）苏木素－伊红厚血膜染色法

本法适用于微丝蚴的形态鉴别。

1.染色液的配制

（1）苏木素染液。苏木素1.0g，95%酒精6ml，饱和硫酸铵100ml；先将苏木素与酒精混合，然后加饱和硫酸铵于日光下晒或置于温箱中，经过两周后，待其成熟，加甘油25ml和甲醇25ml，再经数日（3～5d）后过滤。

（2）%伊红水溶液。

2.染色法　检样制成厚血膜，自然干燥；用清水溶去血红蛋白，自然干燥；用纯酒精或甲醇固定20～30min，待干，置苏木素染液内染色10～15min。蒸馏水或清水洗涤1～5min，使血膜呈蓝色，置于1%伊红水溶液中染色0.5～1min，取出，迅速用水洗涤2～5min，待干，镜检。

3.结果　微丝蚴鞘膜呈淡红色，体细胞呈紫色，染色清晰。

（四）明矾苏木素快速厚血膜染色法

1.染色液的配制　苏木素1.5g，蒸馏水500ml，碘酸钠25g；先将苏木素溶于蒸馏水中，再加明矾和碘酸钠，待全部溶解后过滤备用。

2.染色法　用清水将厚血膜溶血，待干，用甲醇或无水酒精固定，置于预先经60℃加温的明矾苏木素染液内染色2～4min（染色时间可酌情增减，如着色过深，可移于0.5%～1%盐酸稀释液中脱色数秒钟，然后迅速用流水冲洗）。流水洗涤，待干，镜检。

3.结果　染色后的微丝蚴着色均匀，体柱细胞呈蓝紫色，结构明显，容易作鉴别观察且长期不褪色。