反向系列探针杂交法

第六节　反向系列探针杂交法

由于反向系列探针杂交技术操作相对简便、快速，且价格相对低廉，目前，许多学者也探索其在分枝杆菌菌种鉴定等领域的应用可能性。 1995年，Kox等根据16SrRNA高变区序列设计出一系列种特异性探针，通过反向印迹杂交试验能将临床标本中分枝杆菌鉴定至种。Sanguinetti等在Kox的工作基础上，将16SrRNA的种特异性探针从8个增加到16个，通过反向系列探针技术检测了5466份来自BACTEC液体培养基的分离株，其中检测出分枝杆菌阳性菌株459例，依据特异性探针杂交模式，检出的NTM包括蟾蜍、鸟、戈登、偶发、海、堪萨斯、龟、胞内、玛尔摩、土和日内瓦等共11种分枝杆菌，其结果与常规生化鉴定结果和HPLC进行分枝菌酸的鉴定结果一致，充分显示了反向系列探针杂交技术在分枝杆菌菌种鉴定中的简便、快速和准确的特点。

1997年，Patel等建立了PCR-ELISA（PCR-Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay）微孔板杂交技术，也属于反向杂交技术范畴，其将分枝杆菌16SrDNA扩增产物在微孔板内与分枝杆菌16SrDNA种特异性寡核苷酸捕捉探针杂交，对分枝杆菌进行菌种鉴定，35株分枝杆菌临床分离株中，34株得到正确鉴定。该方法也具备简便、快速的特点，显色反应类似于ELISA，适于在临床实验室推广应用。目前，国外利用反向系列探针技术原理，已开发出进行分枝杆菌菌种鉴定的试剂盒，一个是INNO-LiPA Mycobacteria，由比利时的Innogenetics公司开发；一个是GenoType Mycobacteria，由德国的Hain Diagnostika公司开发。这些产品目前已在许多欧美国家的科研机构进行了大量的临床研究。应用INNO-LiPA Mycobacteria和GenoType Mycobacteria线条探针杂交试剂盒，Trombert-Paolantoni等检测了来自法国的临床分枝杆菌分离株，INNO-LiPA和GenoType Mycobacteria对分枝杆菌的检出率分别为88%和95%。Sarkola等使用GenoType Mycobacteria检测来自芬兰的178株临床分枝杆菌分离株，89.3%的检测结果同使用16SrDNA序列测定结果吻合。不同作者使用探针阵列对分枝杆菌的检测敏感度存在差别，原因主要包括检测的靶基因不同，所设计探针的序列不同，特别是使用的研究材料不同。检测结果很大程度上取决于不同国家和地区分枝杆菌的种类、发病率和ITS序列的种内差异程度。

目前，关于分枝杆菌菌种鉴定的研究，无论是试剂盒研制，还是临床研究报道主要来自欧美发达国家。但已有较多的分枝杆菌菌种鉴定的报道显示，不同的地理区域分枝杆菌的发生率各不相同，种内的基因序列也存在较大差异，进一步加大对不同地区来源的分枝杆菌菌株的菌种鉴定靶基因进行深入研究，积累和补充相关的基因序列，开发、完善和优化分枝杆菌种特异性探针，将有可能使反向系列探针技术早日成为临床实验室快速、准确进行分枝杆菌菌种鉴定的新手段。