荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是利用标记了生物素、地高辛或荧光素的DNA探针,检测组织细胞中特异DNA序列,通过荧光素显示杂交信号的DNA-DNA原位杂交方法。FISH实验操作与非荧光原位杂交检测相似。一般新鲜组织、冷冻组织样本、细胞涂片/爬片及分裂中期染色体等材料的FISH结果要优于石蜡包埋组织样本。
FISH所用的探针大致可以分为3类。①序列重复探针,例如α卫星探针、β卫星探针、经典卫星探针,其杂交靶位常大于1Mb,不含散在重复序列,与靶位结合紧密,杂交信号强,易于检测;②全染色体或染色体区域特异性探针,由一条染色体或染色体上某一区段的极向不同的核苷酸片段所组成,可从克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得,广泛应用于遗传病和肿瘤的检测;③位点特异性探针,由一个或几个克隆序列组成,主要用于特定遗传病及染色体微缺失综合征的诊断。
(一)FISH方法
1.直接法 将标记荧光素的探针与组织切片、间期细胞及染色体等标本上的靶核苷酸进行DNA-DNA原位杂交,形成带有荧光素的杂交体,在荧光显微镜下直接观察结果。该方法简单、快速,但敏感性较低,信号较弱。
2.间接法 探针由非荧光素(生物素、地高辛等)标记,通过亲和连接或免疫反应带入各种发光物质来检测杂交体。该方法对杂交信号有放大作用,敏感性较高。多色FISH技术也是利用此方法,通过杂交不同标记物的探针,利用不同颜色的荧光素检测,能够同时得到多种颜色荧光信号,实现同时检测多种靶核苷酸的目的。
(二)直接法染色体荧光原位杂交操作程序
1.中期染色体制备
(1)细胞培养64~68h,加秋水仙碱(终浓度为0.07μg/ml),继续培养30min。
(2)离心,弃上清液,加0.075%KCl 10ml,37℃,15~30min。
(3)离心,弃上清液,加甲醇/冰醋酸(3∶1)固定液5ml,混合,置于-20℃过夜。
(4)离心,弃上清液,用上述固定液清洗2次。
(5)离心,弃上清液,视细胞数多少,加固定液制成细胞悬液。
(6)取2~3滴细胞悬液滴到清洁载玻片上,并使细胞沿载玻片长轴均匀分布。
(7)在37℃温箱干燥3d(最佳使用期限为3~14d)。如需急用,烤片温度可提高到45~55℃,1d后即可使用。
2.RNA酶处理
(1)滴加RNA酶200μl(100μg/ml,溶于2×SSC),加盖玻片,37℃,30~60min。
(2)2×SSC溶液清洗10min。
(3)预冷的梯度乙醇(70%,85%,100%)脱水,每次2min。
(4)空气干燥。
3.变性
(1)将切片置于变性液(70%甲酰胺/2×SSC,p H 7.0)中,74℃,5min。
(2)立即移入-20℃预冷的70%乙醇约1min,终止变性,轻轻振摇洗去变性液。
(3)梯度乙醇脱水(85%,100%)各1min。
(4)取出切片,拭干切片背面的水分,空气干燥。
4.探针变性及杂交
(1)将2μl FITC标记探针加入杂交缓冲液。
(2)75℃变性5min,转入37℃预杂交20~30min。
(3)将含探针的杂交液滴在载玻片组织上,加盖玻片,四周用橡皮泥封闭。
(4)置于湿盒内,37℃杂交过夜。
5.杂交后清洗
(1)小心去除封闭用的橡皮泥及盖玻片。
(2)用蒸馏水洗片,45℃,洗3次,每次5~10min。
(3)用含0.05%Tween-20的4×SSC洗片,室温,洗3次,每次2min。
(4)4×SSC洗片,室温,2min。
6.复染,封片
(三)间接法荧光原位杂交操作程序
1.标本制备
(1)石蜡切片标本准备:①常规脱蜡水化;②蛋白酶消化,37℃孵育15~30min;③蒸馏水洗2次,每次5min;④2×SSC冲洗2次,每次5min;⑤预冷梯度乙醇(70%,80%, 90%,100%)脱水,每次2min;⑥空气干燥。
(2)冷冻切片/细胞涂片标本准备:①切片在室温下干燥30min;②置入-20℃预冷甲醇30min,转入固定液(甲醇/冰醋酸=3∶1)20min;③蒸馏水洗5min;④预冷梯度乙醇(70%,80%,90%,100%)脱水,每次2min;⑤空气干燥;⑥RNA酶(RNA酶溶于含有0.07%Triton X-100的2×SCC)处理,37℃,1h,蒸馏水洗涤3次,每次5min;⑦蛋白酶消化,37℃孵育15~30min;⑧蒸馏水洗2次,每次5min;⑨2×SSC冲洗2次,每次5min;⑩预冷梯度乙醇(70%,80%,90%,100%)脱水,每次2min;空气干燥。
2.变性
(1)探针变性:将探针在75℃恒温水浴中温育5min,立即置0℃,5~10min,使双链DNA探针变性。
(2)标本(待测DNA)变性:将切片浸于70~75℃变性液(70%甲酰胺/2×SSC中变性)5~10min后立即移入预冷梯度乙醇(70%,80%,90%,100%)脱水,每次5min,空气干燥。
3.杂交 将已变性DNA探针10μl滴于已变性并脱水的标本上,盖上盖玻片,蜡膜封片,置于潮湿暗盒中37℃孵育12~16h。
4.杂交后漂洗
(1)取出标本,用镊子小心去除盖玻片。
(2)切片标本置于已预热42℃的50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次,每次5min。
(3)在已预热42℃的1×SSC中洗涤3次,每次5min。
(4)切片在2×SSC中轻洗一下。
(5)取出切片,置于PBS内待检测。
5.检测
(1)取出切片,除去多余水分,滴加FITC卵白素或罗丹明抗地高辛抗体30~60μl/张,室温孵育20min,保鲜膜覆盖。
(2)去除保鲜膜,PBS室温洗3次,每次2min。
6.杂交信号放大
(1)取出切片,除去多余水分,滴加抗卵白素抗体或抗-罗丹明抗地高辛抗体30~60μl/张,室温下孵育20min,保鲜膜覆盖。
(2)去除保鲜膜,PBS室温洗3次,每次2min。
(3)除去多余水分,滴加FITC卵白素或罗丹明抗地高辛抗体30~60μl/张,室温下孵育20min,保鲜膜覆盖。
(4)去除保鲜膜,PBS室温洗3次,每次2min。
7.细胞核染色 滴加PI/antifade 10~20μl或DAPI/antifade染液,盖好盖玻片,室温孵育2~5min。
8.封片 可选用不同的封片液。如果封片液不含Mowiol(具有使封片液产生自封闭的作用),为防止盖玻片与载玻片之间的溶液挥发,可使用指甲油将盖玻片周围封闭。封好的标本可以在-20~-70℃冰箱的暗盒中保存数月。
9.结果观察 先在可见光源下找到要观察的视野,然后打开荧光激发光源,FITC的激发波长为490nm,罗丹明的激发波长为550nm。细胞核被PI染成红色,被DAPI染成蓝色。FITC标记探针所在的位置发绿色荧光,罗丹明标记探针所在位置发橙红色荧光(彩图7)。
附:常用溶液配制方法
1.PI/antifade溶液
(1)PI原液:先以双蒸水配制浓度为100μg/ml的PI溶液,取出PI溶液1ml,加39ml双蒸水,制成终浓度2.5μg/ml的PI原液。
(2)Antifade原液:以PBS缓冲液配制该溶液,使其浓度为10mg/ml,用0.5mmol/L的Na HCO3调p H为8.0。取上述溶液1ml,加9ml甘油,混匀。
(3)PI/antifade溶液:PI与antifade原液按体积比1∶9比例充分混匀,-20℃保存备用。
2.DAPI/antifade溶液 用去离子水配制1mg/ml的DAPI储存液,再按体积比1∶300,用antifade溶液将储存液稀释成工作液。
3.荧光检测试剂稀释液 用1ml 5%BSA、1ml 20×SSC、3ml双蒸水与5μl Tween-20混合配成。
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