芯片杂交标记方法

生物芯片（biochip）技术是20世纪90年代初期发展起来的一项生物高新技术，包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、微流体芯片、缩微芯片等。目前生物芯片中发展最成熟的是基因芯片。

基因芯片（或称为DNA微阵列，DNA microarray）技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先合成的基因探针（cDNA、寡核苷酸）有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。其基本原理是核酸分子杂交，即一种大规模集成的固相杂交（反向点杂交）。

根据芯片上探针分子种类的不同，基因芯片可以分为寡核苷酸芯片、cDNA芯片两大类。基因芯片技术的方法主要包括4个方面：芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分析，其技术流程如图9-10所示。

图9-10 基因芯片技术流程

一、基因芯片的制备或选择

（一）基因芯片的制备

基因芯片的制备方式有两种：①核酸的原位合成；②将事先制备好的基因探针有序地固化于支持物表面。

通过采用显微光蚀刻（照相平板印刷）、压电打印、分子印章等技术，在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片，代表性的芯片包括Affymetrix公司的GeneChip产品系列等。

另一大类更常见的制备方式是在芯片以外，采用常规分子生物学技术，如基因克隆与PCR扩增、人工合成寡核苷酸等，预先制备cDNA或合成寡核苷酸探针，然后通过精密的自动化机械系统将探针点样或打印到包被的固相支持物（或称载体）上的一个较小的区域，然后再固定在支持物上。其制备过程主要包括：①探针的设计与制备；②支持物的选择[如显微镜载玻片、滤膜（如尼龙膜或硝酸纤维素膜）]与预处理（氨基化、醛基化或环氧基包被）；③探针的点样与固化（可采用接触式或非接触式点样，自动化机械系统可选择Cartesian Technology、GeneMachines’OmniGrid等公司的系统）。

（二）基因芯片的选择

研究者针对某一特定实验选择基因芯片（微阵列）时，需要考虑以下几个方面的因素：①自制芯片、定制芯片或购买商业化芯片；②芯片种类（cDNA芯片或寡核苷酸芯片）；③芯片的密度即探针的量。其他因素包括花费等。

对于大多数不具备制备芯片条件的研究者来说，主要通过购买商业化芯片来进行微阵列实验。商业化芯片制备的质量均一、质量控制好。研究者可以利用商家提供的一些探针信息（克隆资源）以及标记、杂交和信息处理的技术支持与服务。商业化芯片的价格较高、灵活性有限（研究者的选择有限）。

对于实验室已建立芯片制备技术与平台的研究者来说，自制芯片无疑是很好的选择。自制芯片的优点包括灵活性高，研究者可以根据实验需要制备足够量的芯片，芯片上的探针也可根据具体情况来设计、添加，研究过程自主控制，对商家依赖性小。在需要大量芯片进行微阵列实验时花费也相对较低。缺点主要是对制备技术、质量控制要求较高。

另一个可供选择的方案是定制芯片，即寻找具备芯片制备条件的实验室或中心，提出微阵列实验的方案及芯片的需求，让该中心根据实验的需要设计、制备实验相关的探针，制作芯片。定制芯片的灵活性要高，费用也相对较低。

二、样品的准备

选择或制备基因芯片后，接下来利用该芯片来检测样品中所含基因信息以及基因表达的信息。

样品的准备过程包括采用常规方法从组织细胞中分离纯化样品核酸，再对待测样品中的靶DNA进行特异性扩增，并在扩增过程中进行标记。

目前样品的标记主要采用荧光标记法，也可用生物素、放射性核素等标记，样品的标记在其PCR扩增、反转录等过程中进行。反应中DNA聚合酶、反转录酶等可选择荧光标记的dNTP作为底物，在拷贝延伸的过程中，将其掺入到新合成的DNA片段中。此外，PCR过程中还可应用末端荧光标记的引物，使新形成的DNA链末端带上荧光。常用的荧光分子包括Cy3、Cy5、FITC和TRITC（罗丹明）或生物素等，其中生物素可用链霉亲和素偶联的荧光素或丽丝胺、藻红蛋白等引导进一步检测。基因表达谱实验中待测样品和对照样品可采用双色荧光标记，如待测用红色（Cy3），对照用绿色（Cy5）荧光标记。常用的标记方法包括反转录标记法、随机引物延伸法、PCR线性扩增法等。

下面以反转录标记法为例，其过程如下：从组织或细胞中提取总RNA，纯化mRNA，然后以Oligo dT为引物，加入荧光标记的dNTP（dCTP或dUTP），进行反转录合成cDNA第一链。或者直接以总RNA为模板进行oligo dT标记，而不必进行mRNA纯化步骤。实验表明，总RNA标记同样可以提供相当的标记活性，且不增加背景荧光。标记时将不同来源的正常、异常样品分别用荧光标记以进行比较分析。

由于带有荧光标记的dNTP，可能会影响反转录及PCR产物的形成，所以，在反转录及PCR过程中，同时加入带荧光标记的dNTP和相对应的、不带标记的dNTP（如Cy3-dCTP和dCTP），并调整这两者之间的比率，以使得反转录及PCR产物的产量和荧光标记dNTP在新合成DNA分子中的掺入率达到一个平衡的水平，且使杂交信号最强。

【材料】

1． Oligo-dT（12-18 mer），用0.1% DEPC处理水灭活RNA酶。

2． 100 mmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP。

3． 5 mmol/L DTT。

4． 1 mmol/L Cy3-dUTP、1 mmol/L Cy5-dUTP （Amersham Pharmacia）。

5． SuperScript II反转录酶（无RNase H活性）（Gibco BRL）。

6． 玻璃纤维过滤柱（Pharmacia）。

【操作步骤】

三、杂交与杂交后清洗

芯片的杂交过程与常规的分子杂交过程基本相似，先预杂交，再加入含靶基因的杂交液杂交3～24h或以上，然后洗脱、干燥，以待检测。

预杂交时可将玻片上的自由氨基或醛基等活性基团封闭或失活，否则标记的样品靶DNA会与玻片上探针外的其他位点发生非特异性结合，从而消耗靶DNA并产生强的背景。此外，还可以洗掉未结合的DNA探针。在杂交过程中，这些未结合的DNA探针与那些结合到玻片上的探针竞争性地结合样品中的靶DNA。

杂交液中还常加入鲑鱼精子DNA、poly A、酵母tRNA和Cot-1 DNA等以去除因重复序列所致的非特异杂交。如与cDNA探针杂交时，可用poly A与酵母tRNA或poly A和poly dT丰富区结合而降低非特异本底。

杂交后的芯片要经过严谨条件下的洗涤，洗去未杂交的一切残留物。杂交和洗脱的条件都必须通过实验进行优化以保证特异性。

【材料】

1．去离子甲酰胺

2．1%牛血清白蛋白（BSA），Sigma

3．人Cot1-DNA （20mg/ml），LifeTechnologies

4．poly（A）-DNA （20mg/ml），Pharmacia

5．杂交盒（Corning）

6．缓冲液的配制

预杂交液　　　5×SSC　　　　0.1%SDS　　　1%BSA

2×杂交缓冲液　50%甲酰胺　　10×SSC　　　0.2%SDS

洗液1　　　　 1×SSC　　　　2%SDS

洗液2　　　　 0.1×SSC　　　0.2%SDS

洗液3　　　　 0.1×SSC

【操作步骤】

四、杂交结果的检测

以基因芯片扫描仪对芯片进行扫描，然后以相关的芯片分析软件进行图像的处理与分析。

基因表达谱分析时必须对微阵列上阳性杂交点的荧光强度进行处理、分析才能鉴定出差异表达的基因。第一步就是对每个扫描波段的相对荧光强度进行标准化处理。标准化就是校正荧光标记物的标记效率和检测效率之间的差异。这些差异可导致Cy5和Cy3平均比值的波动。因此，在分析前就必须对荧光强度进行校正。标准化策略基于一些假设，如芯片上部分基因（如一些管家基因）或者是某些外加的对照基因，其所检测到的表达的平均比率应该为1。

标准化后，进行Ratio分析（即比值分析），以鉴定差异表达的基因。一般认为，Cy3与Cy5的比值（Cy3/Cy5）在0.5～2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而比值大于2或小于0.5，则认为该基因的表达出现显著改变（即为差异表达基因）。

基因芯片杂交结果中几种常见问题的分析与解决方案，见表9-7。

表9-7 基因芯片杂交结果中几种常见问题的分析与解决方案

（续表）

（彭翼飞 肖维威 李 凌）