用标记探针的斑点杂交的不同之处

将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行杂交，用于基因组中特定基因及其表达的定性、定量研究。根据点样模具不同，点样形状分别呈圆形或狭缝状而称为斑点杂交（dot blotting）或狭线杂交（slot blotting）（图9-5）。

图9-5 斑点杂交、狭线杂交式样

斑点（狭线）杂交是实验室常用技术之一。与Southern及Northern印迹杂交法相比，其优点是简单、迅速，样品不必用内切酶消化或电泳分离可在同一张膜上同时进行多个样品的检测，对于核酸粗提样品的检测效果也较好。其缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性不高，有一定比例的假阳性结果。常应用于病原体基因，如微生物的基因检测，也可用于检查人类基因组中的DNA序列。近年来研究人员又推出了应用于单个碱基突变的基因诊断方法——反向斑点杂交（reverse dot-blot hybridization，RDB杂交）技术。其基本原理是应用生物素标记的特异性引物扩增目的DNA，使PCR产物上带有生物素标记物，将PCR产物变性后与固定在膜上的寡核苷酸探针进行杂交，然后通过酶免疫显色法获取结果。

【材料】

1．试剂

（1）20×SSC。

（2）甲醛。

（3）去离子甲酰胺。

（4）10%SDS。

（5）20×Denhardt液。

（6）l mol/L Na2HPO4（pH 7.0）。

（7）0.5mol/L EDTA（pH 8.0）。

（8）10mg/ml鲑鱼精DNA。

（9）硫酸葡聚糖。

（10）3%牛血清白蛋白。

（11）100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、l mol/L NaCl。

（12）变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

（13）底物缓冲液：100mmol/L Tris-HCl（pH 9.5）、lmol/L NaCl、5mmol/L MgCl2。

（14）亲合素-碱性磷酸酶。

（15）5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）：10mg溶于200μl二甲基甲酰胺。

（16）氮蓝四唑（NBT）：15mg溶于200μl二甲基甲酰胺。

2．仪器设备 恒温水浴箱、同位素探测仪、自动光密度扫描仪、真空抽滤加样器、X线光胶片盒（带增感屏）、恒温摇床、移液器、Tip头、玻璃刻度吸管（1ml、5ml、10m1）、塑料封口机、尼龙膜、硝酸纤维素膜、紫外透射仪、厚印迹纸（如Whatman 3MM滤纸、Sigma QuickDraw等）、印迹装置。

【操作步骤】

此处主要介绍用α-32P标记DNA 探针的斑点杂交，及其与用光敏生物素标记DNA探针进行斑点杂交的不同之处。

实验流程如下：

1．样膜的制备

2．预杂交

3．杂交

4．洗膜

（1）α-32P标记DNA探针的洗膜

（2）光敏生物素标记DNA探针的洗膜

5．显影

（1）放射自显影

（2）酶联显色反应

6．结果观察 对于放射性元素标记的DNA探针的斑点杂交根据曝光点（或狭缝）的有无及强弱，来判定目的基因的有无及量的多少。

而对光敏生物素标记DNA 探针的斑点杂交，则根据蓝紫色斑点（狭缝） 的有无及颜色深浅，来判定目的基因的有无及量的多少。

【注意事项】

1．DNA的变性 斑点印迹的关键是DNA在转印后要完全变性，至少所有样品的变性程度要一致。变性作用如果不一致，使不同样品中可用于杂交的DNA的数量不相同，这样在杂交后，两个斑点显示的相对强度就不能代表它们各自所含的靶DNA的量。解决方法是把膜放到泡在碱液中的滤纸上，高pH使DNA保持在变性状态。

2．DNA样品的纯度 大量DNA斑点／狭线印迹时，由于没有凝胶分离步骤，一起印迹过来的杂质可对杂交产生意想不到的作用，可能阻断杂交位点而减弱信号，或因探针的滞留而加强信号。如果信号强度是用来测靶DNA的绝对量，就要考虑到这些，或者用一系列稀释对照进行比较。斑点印迹用于分析拷贝数尤应慎重，只有细胞和质粒的DNA都是严格纯化了的才能在其印迹间进行比较。

3．固相支持膜的选择 理想的膜应符合以下要求：①具有较强的结合核酸分子的能力；②与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应；③与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不至于脱落或脱落极少；④非特异吸附少，在漂洗过程中能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉；⑤具有良好的机械性能，如柔软性好、韧性强等，以便于操作。

硝酸纤维素膜在高盐浓度下，具有较强的吸附单链DNA和RNA的能力。吸附的核酸经真空80℃烘烤后，依靠疏水性相互作用而结合到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜具有对蛋白质非特异性吸附作用较弱，产生的杂交信号本底较低等特点，这一特点有利于实施非同位素杂交。其缺点是结合核酸能力的大小取决于转印条件和高浓度盐，结合小片段（＜200bp）效率低，质地脆弱，不易操作，不能进行反复杂交。

尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持膜，特别是经过正电荷基团修饰的尼龙膜，结合核酸的能力更强。吸附于尼龙膜的核酸经真空烘烤后，可牢固与膜共价结合。尼龙膜可与小至10bp的片段结合，在低盐条件下也能较好地结合核酸。它的韧性较强，操作方便，可重复用于杂交。尼龙膜的缺点是对蛋白质有一定的吸附作用，产生的杂交信号本底较高，但可用加大预杂交液中非特异性封闭试剂的方法克服。

【结果与分析】

1．实验结果及分析 对于放射性元素标记DNA探针的斑点杂交，根据曝光点（或狭缝）的有无、强弱，可以判定目的基因的有无及量的多少。利用“自动灰度扫描仪”扫描曝光点（狭缝），计算积分光密度值，可以进行半定量分析。

对光敏生物素标记DNA 探针的斑点杂交，出现蓝紫色斑点（狭缝）者为阳性，未着色者为阴性。根据着色的深浅可以判定目的基因的多少。

2．常见问题及解析 见表9-3。

表9-3 斑点杂交常见问题及解析