浙江海洋学院烹饪技术

舟山海域4种低值鱼酶解蛋白亚铁螯合物自由基清除活性与抑菌活性研究

林慧敏　张宾　邓尚贵＊　唐艳　陈丹杰

［作者简介］浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山，316004。第一作者为浙江海洋学院硕士生。＊通讯作者。

［原载期刊］《中国食品学报》2012年第1期。

从上世纪90年代以来，我国水产品产量连续多年位居世界首位。随着海洋渔业生产的发展，经济鱼类逐年减少，低值鱼产量逐年增多，一般占渔获物的28%。这些低值鱼由于价格低，加工和回收手段落后，造成产品使用价值低，资源浪费现象严重，并造成大量营养成分流失，且污染环境［1］。如何利用低值鱼，充分开发利用其蛋白质资源，已引起世界各国的高度重视。

研究发现，食品蛋白质经蛋白酶水解后可获得一些具有广泛生理活性的肽段，但还存在大量没有生物学活性的肽段，这些肽段经过一定修饰后可获得意想不到的活性［2］。选择合适的蛋白酶水解这些多肽链，并进行适当的修饰，可制备出具有各种生理功能的生物活性肽。它们不仅能作为氨基酸的供体，而且也是一类生理调节物［3］。近年来，随着科学研究的深入，各种修饰生物活性肽不断被发现。本试验对舟山海域产量较大的4种低值鱼——马鲛鱼、带鱼、鳀鱼、梅童鱼用碱性蛋白酶酶解，对酶解产物亚铁螯合修饰，并对亚铁螯合多肽清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的活性以及对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌活性进行了测定分析，为进一步进行自由基清除亚铁螯合多肽和抑菌活性物质的分离、鉴定奠定基础。

1材料与方法

1．1材料与仪器

新鲜马鲛鱼、鳀鱼、梅童鱼：舟山北门菜场；带鱼：由浙江兴业有限公司提供。4种低值鱼经粉碎机粉碎后，直接分装成200g／袋，置于－20℃冰箱冷冻室保藏，使用时于前一夜取出置于冰箱冷藏室中过夜解冻；碱性蛋白酶（alkaline proteinase）：购自广西庞博生物有限公司；DPPH、α－脱氧核糖、抗坏血酸（VC）、硫代巴比妥：Sigma公司；试验所用化学试剂均为国产分析纯；菌种为金黄色葡萄球菌（ATCC6633）、大肠杆菌（ATCC8739）、枯草芽孢杆菌（ATCC6051）为实验室保存。

1．2仪器与设备

FD－1000冷冻干燥机：日本；DECTA320A／C p H计：梅特勒托利多公司；DHG－9240A电热鼓风干燥箱：上海精宏公司；90－2型恒温磁力搅拌器：上海爱郎仪器有限公司；N－1000旋转蒸发仪：日本EYELA；U－2800紫外分光光度计：日本日立有限公司；SHAB恒温水浴振荡器：常州国华有限公司。

1．3试验方法

1．3．1酶解及亚铁螯合工艺流程［4］

取鱼蛋白10 g溶于200 m L去离子水，用1 mol／L NaOH调节p H到9．0，20000 IU／g底物加入碱性蛋白酶，40℃酶解8 h。酶解结束后，90℃10min灭酶，5000g离心去沉淀，于旋转蒸发器40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得酶解多肽，备用。

将上述酶解去沉淀后的水解液调节p H至7．0，按体积的2%加入1 mol／L的FeCl2，在40℃恒温振荡合成30 min，于旋转蒸发器40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得多肽－Fe2＋成品，备用。

1．3．2羟自由基清除活性的测定

取4种亚铁螯合多肽及VC配成质量－体积浓度分别为1、2、3、4、6、8、10 mg／mL备用。

取0．2 m L的FeSO4－EDTA混合液（10 mmol／L）于具塞试管中，加入0．2 m L的α－脱氧核糖溶液（20 mmol／L），然后再分别加入不同浓度0．2 m L的测试样品，并用磷酸缓冲液（p H 7．4）定容至1．8 m L，最后加入0．2 m L的H 2 O2（10 mmol／L），37℃水浴保温1 h后加入2．8%的三氯乙酸1 m L终止反应，再加入1%的硫代巴比妥1 m L，混匀后沸水浴加热10 min，冷却后稀释5倍，532 nm处测光吸收值A s。不加样品，同上操作处理，测定对比吸光值A c。样品的自由基清除能力（Scavenging Activity SA）可表示为：

S A（%）＝（A s－A c）／A s×100。

1．3．3超氧阴离子自由基清除活性的测定［5］

取4种亚铁螯合多肽及VC配成质量－体积浓度分别为1、2、3、4、6、8、10 mg／m L备用。取邻苯三酚0．1 m L并加入Tris－HCl（p H 8．2）缓冲溶液5 m L于试管中，加入不同浓度的水解液0．25 m L，迅速混匀，25℃水浴保温15 min后使用1 cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320 nm处时测吸光度A i，并测定本底扣除水解自身的干扰，水解液对超氧阴离子自由基清除率按式（1）计算。

清除率 S＝［A 0－（A i－A j）］／A 0×100%（1）

式中：A 0——试剂空白的吸光度值；

　　　A j——样液的吸光度值；

　　　A j——样液本底的吸光度值。

1．3．4 DPPH自由基清除活性的测定

取4种亚铁螯合多肽及VC配置成质量－体积浓度分别为1、2、3、4、6、8、10 mg／m L备用。将1．5 m L DPPH溶液（0．1 mmol／L，溶于95%乙醇）置于试管中，加入1．5m L待测液（1．3 m L蒸馏水＋0．2 m L酶解液），振荡摇匀，室温放置30 min后在517 nm处测定其吸光值（A i），空白为1．5 m L，95%的乙醇加入1．5 m L蒸馏水调零，对照为1．5m L DPPH自由基溶液加上1．5 m L蒸馏水在测定波长的吸光值（A c），酶解液在测定波长的吸光值为A j。酶解液对DPPH的自由基的清除能力用R表示［6］：

1．3．5亚铁螯合多肽抑菌活性的测定

取4种亚铁螯合多肽配成质量－体积浓度分别为1、2、3、4、6、8、10 mg／m L备用。抑菌活性试验采用牛津杯法［7］：取浓度为6×108 CFU／m L的葡萄球菌菌液200μL分别均匀涂布在营养琼脂培养基上，将灭菌的牛津杯置于培养基上，每个培养基均匀放置4个牛津杯。将已稀释成不同浓度的亚铁螯合多肽加入牛津杯中，每个牛津杯中加入药量200μL，每个浓度做3个重复。阴性对照为未螯合的酶解液，平皿先在4℃冰箱放置2 h，使药液充分扩散到琼脂层中，然后将平皿放入37℃恒温培养箱中培养，24 h后观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈直径，计算平均值，用抑菌圈直径表示抑菌活性。

2结果与讨论

2．1对羟自由基的清除作用

羟基自由基是生物体内活性最强的自由基之一，可与生物体内的多种生物大分子产生作用，从而破坏其原有功能，对生物机体造成伤害［8］。图1为不同浓度的低值鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽及抗坏血酸（VC）对羟自由基清除作用的试验结果。

图1　不同质量浓度的低值鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽与VC对羟自由基的清除作用

由图1可知，4种低值鱼酶解蛋白未螯合水解物没有明显的羟自由基清除作用，而亚铁修饰后的螯合多肽对羟自由基的清除作用有明显的量效关系。在质量浓度1～4 mg／m L的范围内，其对羟自由基的清除率随着亚铁螯合多肽浓度的增加而近似线形地增加；当酶解产物质量浓度为4 mg／m L时，梅童鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽对羟自由基的清除率达63．87%；当酶解产物质量浓度超过4 mg／m L时，清除率随浓度的增加增幅降低。因此梅童鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽的清除羟自由基活性最强，其活性和同浓度的VC相当。呈现此现象一是底物原料蛋白的不同造成生成的酶解产物各异；二是亚铁螯合位点不同使产物多肽的N－末端、C－末端氨基酸组成及排列各异，这是影响产物肽功能活性的主要因素。

2．2对超氧阴离子自由基的清除作用

超氧阴离子自由基（O－2）是一种重要的活性氧粒子，它是有氧代谢等生命活动过程不断产生的中间产物，适当量的活性氧自由基粒子的存在有利于维持机体免疫应答，而过量的活性氧自由基存在则会对生物机体产生毒害作用，生物体的衰老及许多疾病的发生都与活性氧粒子有直接的关系［8］。由图2可知，4种低值鱼酶解蛋白未螯合水解物没有明显的超氧阴离子自由基清除作用。亚铁修饰后的螯合多肽对超氧阴离子自由基呈现不同能力的清除作用，但作用相对较弱，相同浓度范围内的VC对超氧阴离子自由基清除率在质量浓度1 mg／m L时达69．09%，质量浓度高于1 mg／m L时清除率均在80%以上，而马鲛鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽质量浓度达10 mg／m L时，对超氧阴离子自由基清除率也只达到62．77%。这表明4种低值鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽对超氧阴离子自由基的作用均较弱。

图2　不同质量浓度的低值鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽与VC对超氧阴离子自由基的清除作用

2．3对DPPH自由基的清除作用

二苯基苦味酰基自由基（DPPH自由基）是一种很稳定的自由基，在乙醇溶液中呈深紫色，在517 nm处有最大吸收峰，尽管DPPH自由基并非人体内产生的自由基，但此法仍能有效评价物质的抗氧化性，因此自Blois将其运用于抗氧化剂的研究，该法也广泛用于清除自由基的研究［9—10］。图3为4种低值鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽与VC对DPPH自由基的清除作用。由图3可知，未螯合的酶解物没有明显的DPPH自由基的清除作用，而在质量浓度1～4mg／m L时马鲛鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽DPPH自由基清除作用相对较弱，在质量浓度高于5mg／m L时，它对DPPH自由基的清除作用大幅增强，在质量浓度5mg／m L时清除率为62．71%，略低于相同浓度VC对DPPH自由基的清除作用，但与其他几组亚铁螯合多肽DPPH自由基清除作用相比要强。DPPH自由基是一种人工合成的稳定自由基，可接受电子或氢成为抗磁性的稳定分子［9］。梅童鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽可能含有较多的可向DPPH自由基提供电子或氢的基团。

图3　不同质量浓度的低值鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽与VC对DPPH自由基的清除作用

2．4亚铁螯合多肽抑菌活性的测定

由表1可知，4种低值鱼未螯合的酶解物没有出现抑菌活性（各对照组），而亚铁修饰后的酶解多肽对待测菌株出现不同程度的抑菌作用。

表1　不同浓度的低值鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽对被测菌体的抑菌效果（抑菌圈直径：mm）

注：“－”代表无抑菌活性

3结论

（1）4种低值鱼碱性蛋白酶酶解多肽没有明显的自由基清除活性，但通过亚铁修饰后的酶解多肽出现不同程度的自由基清除活性。其中，梅童鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽表现较强的羟自由基清除活性（4 mg／mL清除率达63．87%），马鲛鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽表现较强的DPPH清除活性（5 mg／mL清除率达62．71%），略低于同质量浓度的抗坏血酸的清除率。

（2）4种低值鱼中带鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽对3个待测菌株都表现出明显的抑菌活性，而马鲛鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽则没有明显的抑菌活性。

（3）本试验结果表明，通过亚铁修饰后的4种低值鱼酶解多肽具有很好的抗氧化活性及抑菌活性。但有关低值鱼蛋白酶解多肽亚铁螯合的机理和应用还有许多问题有待研究，如亚铁螯合位点、清除自由基及抑菌的生物学效应以及在亚铁螯合多肽在胃肠道的稳定性和吸收等问题。

参考文献

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