微生物限度薄膜过滤法检查

第六节　微生物限度薄膜过滤法检查

一、概念

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌素、酵母菌数及控制菌检查。

二、要求

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。

除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30℃～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25℃～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。

检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml或10cm²为单位报告。

三、检验量

检验量即一次试验所用的供试品（g、m或cm²）。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10 g或10ml；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加10g或10ml。检验时，应从两个以上最小包装单位中抽取供试品。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。

四、供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，可采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1h。

1.液体供试品

取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

2.固体、半固体或黏稠性供试品

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

3.非水溶性供试品

方法1：取供试品5g（5ml），加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80.3g、单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。

方法2：取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10min，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。

4.肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1∶10的供试液。

5.气雾剂、喷雾剂供试品

取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1h，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10的供试液。

6.具抑菌活性的供试品

（1）培养基稀释法。取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

（2）离心沉淀集菌法。取一定量的供试液，3000转/分离心20min（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5min，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。

（3）中和法。凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

7.薄膜过滤法

采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于0.45μm，直径一般为50mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物被充分截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前，应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总冲洗量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备1张滤膜。

阴性对照试验：取试验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

培养和计数：每片滤膜上的菌落数应超过100个。

菌数报告规则：以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数。

8.微生物限度标准

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害而制定的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，中药提取物及辅料的检验，新药标准制定，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。

（1）制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂，应符合无菌检查法规定。

（2）内服给药制剂。细菌数每1g不得过1000个，每1ml不得超过100个；霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得超过100个；大肠杆菌每1g或1ml不得检出。

（3）局部给药制剂。①用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂：应符合无菌检查法规定。②用于眼部给药制剂：细菌数每1g或10 cm²不得超过1000个，每1ml不得超过100个；霉菌数和酵母菌数每1g、1ml或10 cm²不得超过100个；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、1ml或10 cm²不得检出。③用于耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂：细菌数每1g或10 cm²不得超过10000个，每1ml不得超过100个；霉菌数和酵母菌数每1g、1ml或10 cm²不得超过100个；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、1ml或10 cm²不得检出；大肠杆菌每1g、1ml或10cm²不得检出。④用于阴道、尿道给药制剂：细菌数每1g或1ml不得超过10个；霉菌数和酵母菌数每1g、1ml或10 cm²不得检出；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌每1g、1ml不得检出。⑤用于直肠给药制剂：细菌数每1g不得超过1000个，每1ml不得超过100个；霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得超过100个；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。⑥用于其他局部给药制剂：细菌数每1g、1ml或10 cm²不得超过100个；霉菌和酵母菌数每1g、1ml或10 cm²不得超过100个；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、1ml或10 cm²不得检出。

（4）含动物组织（包括提取物）的内服给药制剂。每10g或10 ml还不得检出沙门氏菌。

（5）有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准。

（6）霉变、长螨者以不合格论。

（7）原料及辅料参照相应制剂的微生物限度标准执行。