抗生素微生物检定法

第十节　抗生素微生物检定法

一、概念

本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。抗生素微生物检定包括2种方法，即管碟法和浊度法。

二、技术依据及原理

抗生素微生物检定法，依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。

抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内呈球面型扩散，形成含有一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈线型关系，通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

抗生素效价以“单位（u）”或“微克（μg）”表示。

三、管碟法

本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

1.悬液的制备

枯草芽孢杆菌悬液：取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501或CVCC717］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35℃～37℃培养7天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30min灭活，备用。

短小芽孢杆菌悬液：取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202或CVCC709］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。

金黄色葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003或CVCC1882］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35℃～37℃培养20～22h。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

藤黄微球菌悬液：取藤黄微球菌［CMCC（B）28001或CVCC1600］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24h，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

大肠杆菌悬液：取大肠杆菌［CMCC（B）44103或CVCC2801］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35℃～37℃培养20～22h。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。

2.标准品溶液的制备

标准品的使用和保存，应按照标准品说明书的规定。临用时按规定进行稀释。

3.供试品溶液的制备

精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度。

4.双碟的制备

取直径90mm、高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20ml，使其在碟底内均匀摊布，放置水平台上使其凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48℃～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得到清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外径7.8mm±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。

5.二剂量法

取按照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高、低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2∶1或4∶1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径，照生物检定统计法进行可靠性测验及效价计算。

6.三剂量法

取照上述方法制备的双碟不得少于6个，在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度、中浓度及低浓度的标准品溶液，其余3个小管分别滴装相应的高、中、低3种浓度的供试品溶液；3种浓度的剂距为1∶0.8。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径，照生物检定统计法进行可靠性测验及效价计算。

四、浊度法

本法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。

1.菌悬液制备

金黄色葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26 003或CVCC1882］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35℃～37℃培养20～22h。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

大肠杆菌悬液：取大肠杆菌［CMCC（B）44 103或CVCC2801］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35℃～37℃培养20～ 22h。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。

白色念珠菌悬液：取白色念珠菌［CMCC（F）98001］的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于10mlVI号培养基中，置35℃～ 37℃培养8h，再用VI号培养基稀释至适宜浓度，备用。

2.标准品溶液的制备

标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。

3.供试品溶液的制备

精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量有关规定稀释至与标准品相当的浓度。

4.含试验菌液体培养基的制备

临用前，取规定的试验菌悬液适量（35℃～37℃培养3～4h后测定的吸光值在0.3～0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1）加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的试验菌悬液—供试品溶液浓度反应关系和适宜的测定浊度。已接种试验菌的液体培养基应立即使用。

5.检定法

（1）标准曲线法。除另有规定外，取适宜的、大小厚度均匀的、已灭菌试管，在各种项下规定的剂量反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1∶1.25或更小），供试品根据估计效价或标示量溶液选择中间剂量，每一剂量不少于3个试管。在各试验管内精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml，再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0 ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4h），在线测定或取出立即加入甲醛溶液（1→3）0.5ml，以终止微生物生长，在530nm或580nm波长处测定各管的吸光度。同时，另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml，其中一支试管与上述各管同法操作为细菌生长情况的阳性对照，另一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为吸光度测定的空白液。照标准曲线法进行可靠性测验和效价计算。

（2）标准曲线的计算。以标准品的各浓度1g值及相对应的吸光度求得线性关系。按公式（1）和（2）分别计算标准曲线的直线回归系数（即斜率）b和截距a，从而得到相应标准曲线的直线回归方程（3）。

直线回归：Y＝bX＋a　　　　　　　　　　　　（3）

判断回归得到的方程是否成立，即X、Y是否存在着回归关系，可采用t检验。回归系数的显著性测验如下：

假设H₀：b＝0，在假设H₀成立的条件下，按公式（4）－（6）计算t值。

式中：Y_i为标准品的实际吸光度；

　　　Y为估计吸光度（由标准曲线的直线回归方程（3）计算得到）；

　　　为标准品实际吸光度的均值；

　　　X_i为抗生素标准品实际浓度1g值；

　　　为抗生素标准品实际浓度1g值的均值。

对于相应自由度（2n－4）给定的显著性水平α（通常α＝0.05），查表得tα/（2n－4），若│t│＞t_a/_（2n－4），则拒绝H₀，认为回归效果显著，即X、Y具有直线回归关系。

│t│＜t_α/_（2n－4），则接受H₀，认为回归效果不显著，即X、Y不具有直线回归关系。

（3）抗生素浓度1g值的计算。当回归系数具有显著意义时，测得供试品吸光度的均值后，根据标准曲线的直线回归方程（3），按方程（7）计算抗生素的浓度1g值：

（4）抗生素浓度（或数学转换值）可信限的计算。按公式（4）和（8）计算得到的抗生素浓度1g值在95％置信水平（α＝0.05）的可信限。

X₀的可信限计算如下式：

式中：n为标准品的平行测定数；

　　　m为供试品的平行测定数；

　　　X₀为根据线性方程计算得到的抗生素的浓度1g值；

　　　Y₀为抗生素供试品吸光度的均值。

（5）可信限率的计算。按公式（9）计算得到的抗生素浓度（或数学转换值）的可信限率。

式中X₀应以浓度为单位。

（6）供试品含量的计算。将计算得到的抗生素浓度（将1g值转换为浓度）再乘以供试品的稀释度，即得供试品中抗生素的量。

6.二剂量法或三剂量法

除另有规定外，取大小一致的已灭菌的试管，在各品种项下规定的剂量反应线性范围内，选择适宜的高、（中）低浓度，分别精密加入各浓度的标准品和供试品溶液1.0 ml，二剂量的剂距为2∶1或4∶1，三剂量的剂距为1∶0.8。同标准曲线法操作，每一浓度组不少于4个试管，按随机区组分配将各试管在规定条件下培养。按照生物检定统计法进行可靠性测验及效价计算。

五、注意事项

测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90％或高于估计效价的110％时，应调整其估计效价，重新试验。

除另有规定外，本法的可信限率不得大于5％。