真菌病的微生物学检查

第四节　 真菌病的微生物学检查

不同类型的真菌病需要采用不同的诊断方法。真菌感染的动物体内有感染性真菌存在，变态反应性真菌病的动物体内有针对真菌蛋白的抗体或致敏淋巴细胞，而对中毒性真菌病的诊断则应对可疑饲料进行毒素检测。

一、真菌感染

（一）标本的采集与处理

1.浅表感染：用70％酒精擦拭局部，用灭菌刀片刮取皮屑、甲屑或毛发。

2.深部感染：无菌取脓汁、痰液、血液、脑脊髓液、结节等。

标本采集后，可进行显微镜检及分离培养，通过真菌菌落的色泽及形态、菌丝及孢子的形态即可对感染性真菌病进行诊断。

（二）显微镜检

对临床标本如皮屑、毛发、甲屑等做直接涂片、镜检，快速简便，阳性即表示有真菌感染，对临床诊断和治疗具有重要意义。但直接检查阴性也不能排除真菌感染，可做抹片或湿标本片检查。

1.抹片检查：组织、体液、脓汁等材料均可按照细菌抹片的制备方法做成抹片，经姬姆萨染色或革兰染色等适宜方法染色，检查真菌的菌丝及孢子形态。

2.湿标本片：

（1）氢氧化钾片：用于脓汁、结节、毛发等需要透明处理的样本。氢氧化钾溶液能溶解角蛋白并能清除标本中的脓细胞及其他成分而不破坏菌丝和孢子。一般采用10％的氢氧化钾溶液，甲屑、毛发等角质厚的标本用20％的溶液。溶液过浓，涂片易干而形成结晶，造成检查困难。溶液中加入20％甘油可使涂片不易干涸，有助于检查并可延长涂片的保存时间。

（2）乳酸酚棉蓝染色片：乳酸酚棉蓝染色液能杀死真菌并使其呈蓝色，镜下更易分辨，因含有甘油也是最常用的封固保存液。若甲屑和毛发标本角质过厚，直接检查有困难，可先用10％～20％氢氧化钾液处理5～20min使菌丝和孢子充分显露，然后在盖玻片一端加乳酸酚棉蓝液，另一端用吸水纸缓缓地将乳酸酚棉蓝液吸去，直至真菌染色，最后封固检查。

（3）印度墨汁片：专供检查新型隐球菌和其他有荚膜的真菌孢子。

（三）分离培养

临床真菌实验室中广泛使用的沙堡弱琼脂培养基虽适用于分离绝大多数病原真菌，却并不适用于所有的病原菌，如不适用于分离痰中的荚膜组织胞浆菌，但分离出来的荚膜组织胞浆菌在该培养基上却生长良好。所以欲从临床标本中分离病原真菌，必须选择适当的初代培养基，某些深部感染的病料，还需要接种血琼脂。为防止标本中细菌的繁殖和污染，可在培养基中加入金霉素、青霉素、链霉素等抗生素。此外，有时还需加入放线菌酮，以抑制一些霉菌的生长，特别是在分离皮肤癣菌的培养基中。观察菌落的形态及色泽、载片湿室培养上的菌丝及孢子形态，或真菌染色片下真菌的形态结构，以鉴定真菌。

二、变态反应

有些真菌病，如假皮疽组织胞浆菌引起的马流行性淋巴管炎，可用变态反应进行诊断。

三、毒素中毒

对真菌毒素中毒性疾病，一般应对可疑的饲草及饲料进行真菌毒素检查，常用免疫学检测或提取毒素后用薄层层析、气相液相色谱分析等，或接种实验动物。

【案例分析】

某奶牛场十几头奶牛连续发生临床型乳腺炎，体温稍高，患病乳区红肿热痛明显，一个或几个乳区发病，乳汁稀薄，发酸，有的乳汁黄色、分层、有豆腐渣样沉淀，产奶量明显下降。患病一个多月以来，陆续使用过青霉素、链霉素、氧氟沙星、阿米卡星、氨苄青霉素等进行治疗，用药初期病情有所好转，停药后复发，继续用药再无效果。畜主要求对奶牛乳腺炎进行微生物学诊断。

将患病乳房进行消毒处理后，弃前三把奶，采集10mL左右奶样于无菌试管中。将奶样离心后涂片，革兰染色、镜检，发现大量G^＋大球菌，高倍镜下即清晰可见。

将奶样分别划线接种普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基及沙堡弱培养基，37℃培养24～48h。在麦康凯培养基上不生长，在普通琼脂培养基及鲜血培养基上生长，但菌落只有针尖大小，在沙堡弱培养基上生长，形成直径约3mm的乳白色至奶油色的光滑、湿润的大菌落，打开平板有浓厚的酵母气味。挑取菌落进行革兰染色、镜检，发现G^＋大的椭圆形菌，高倍镜下清晰可见；另外，还可见或长或短的杆状细胞，有的有分枝，细胞间连接处狭窄，呈现明显的假菌丝形态。

鉴定引起奶牛乳腺炎的病原菌为酵母菌。采用制霉菌素乳房内灌注，配合中药调理，一周后大部分奶牛乳区红肿热痛症状明显减轻直至消失，产奶量恢复至正常水平，个别重病牛因疗效不佳被淘汰。

【复习思考题】

1.真菌及其主要特性有哪些？

2.什么是真菌的双相性？

3.怎样进行真菌病的微生物学诊断？