肌苷的发酵生产

任务1　肌苷的发酵生产

一、肌苷的概述

1．肌苷的结构

肌苷是由次黄嘌呤的9位氮与D－核糖的1位碳通过β－糖苷键连接而形成的化合物，是核酸中嘌呤组分的代谢中间物，又称次黄嘌呤核苷。其结构式为

2．肌苷的理化性质

肌苷为白色结晶性粉末，味微苦，溶于水，不溶于乙醇、氯仿。在中性、碱性溶液中比较稳定，在酸性溶液中不稳定，易被水解成次黄嘌呤和核糖。常温下（＜20℃），肌苷主要以两个结晶水的晶体形式存在，在较高温度下存在两种无水晶体形式。肌苷分子中的碱基存在酮式和烯醇式互变异构现象，所以在碱性条件下烯醇式结构的分子能显示出弱酸性，能与碱反应生成盐。

3．肌苷的生理功能

肌苷为人体的正常成分，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成，活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，使低能缺氧状态下的组织细胞继续顺利进行代谢，有助于肝细胞功能的恢复，可刺激体内产生抗体并促进肠道对铁的吸收。在临床上，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。

4．肌苷的生产方法

目前，肌苷的生产方法主要有肌苷酸脱磷酸法和直接发酵法。由于发酵法生产肌苷的产率很高，因此现在工业多采用直接发酵法。

1）肌苷发酵机制与肌苷产生菌的选育

肌苷发酵的生产菌种主要有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产氨短杆菌。其中枯草芽孢杆菌的磷酸酯酶活性较强，有利于将IMP脱磷酸化形成肌苷，分泌至细胞外，因此肌苷的发酵多采用枯草芽孢杆菌的腺嘌呤缺陷型。产氨短杆菌的磷酸酯酶活性较弱，这一点有利于积累IMP而不利于积累肌苷，但是产氨短杆菌可能缺损GMP还原酶和AMP脱氨酶，它的嘌呤核苷酸合成途径可能是完全分支的，而不是像枯草芽孢杆菌那样的环形互变，因此产氨短杆菌的GMP和AMP是不能互变的。产氨短杆菌的补救途径的酶活性较强，对产氨短杆菌进行菌种改良，可获得肌苷积累量较高的菌株。

2）发酵生产肌苷的工艺路线

现多利用变异芽孢杆菌7171－9－1进行发酵生产肌苷。生产菌种经活化，转入三角瓶培养，获得一级种子，放大到种子罐，获得二级种子，进行发酵培养。在适当的培养基、温度、pH、通气及搅拌条件下培养93h。发酵液调节pH后直接上732型阳离子交换树脂柱，收集的肌苷洗脱液进行活性炭柱吸附脱色后，在pH为11或6的条件下析晶过滤，得肌苷粗品，重结晶后获得肌苷精品。

也可将去菌体后上柱改为直接上柱，然后用水反冲洗树脂柱。其优点是缩短周期，节约设备，又可把糖、色素、菌体从柱顶冲走，而适当地松动树脂也利于洗脱。此改进可使洗脱得率提高25%左右。在温度较高且pH较低时，部分肌苷会分解成次黄嘌呤。32℃放置15h后洗脱，得率降低10%左右；48h后洗脱，得率降低30%左右；室温20℃放置48 h后洗脱，得率降低约5%。

利用变异芽孢杆菌7171－9－1进行发酵生产肌苷的工艺路线见图5－13。

图5－13　利用变异芽孢杆菌7171－9－1进行发酵生产肌苷的工艺路线

3）肌苷发酵条件

①碳源大多使用葡萄糖。

在发酵生产中也可以考虑利用淀粉水解液。

②常用的氮源有氯化铵、硫酸铵或尿素等。

因为肌苷的含氮量很高（20．9%），所以必须保证供应足够的氮源。工业发酵常用氨水来调节pH，这样既可以提供氮源，又可调节发酵液的pH。

③磷酸盐对肌苷生成有很大影响。

采用短小芽孢杆菌的腺嘌呤缺陷型菌株发酵肌苷，可溶性磷酸盐如磷酸钾可以显著地抑制肌苷的累积，而不溶性磷酸盐如磷酸钙可以促进肌苷的生成。相反的，采用产氨短杆菌的变异株时，肌苷发酵并不需要维持无机磷的低水平，即使添加2%的磷酸盐，也能累积大量的肌苷。

④肌苷生产菌株一般为腺嘌呤缺陷型菌株。

在培养基中必须加入适量的腺嘌呤或含有腺嘌呤的物质，如酵母膏等。由于腺嘌呤是腺苷酸的前体，而腺苷酸又是控制IMP生物合成的主要因子，所以，加入腺嘌呤的多少不仅影响菌体的生长，更影响肌苷积累。腺嘌呤对肌苷积累有一个最适浓度，这个浓度通常比菌体生长所需要的最适浓度小一些，称为亚适量。

⑤氨基酸有促进肌苷积累，同时节约腺嘌呤用量的作用。

其中组氨酸是必需的，异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸等8种氨基酸也有促进作用。这8种氨基酸可以用高浓度的苯丙氨酸来代替。氨基酸可通过促进菌体生长使肌苷产量增加。

⑥培养基以外的发酵条件，如pH、温度、通气搅拌等也都是影响肌苷积累的重要因素。

肌苷积累的最适pH为6．0～6．2；最适温度对枯草芽孢杆菌为30℃，对短小芽孢杆菌为32℃；供氧不足可使肌苷生成受到显著的抑制，从而积累一些副产物，通气搅拌则可以减少CO₂对肌苷发酵的抑制作用。

二、菌株的活化

变异芽孢杆菌7171－9－1移种到斜面培养基上，30～32℃培养48h。在4℃冰箱中菌种可保存1个月。

斜面培养基配方：葡萄糖1%，蛋白胨0．4%，酵母浸膏0．7%，牛肉浸膏1．4%，琼脂2%，pH为7，在120℃灭菌20min。

三、种子培养

一级种子：培养基配方为葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%，玉米浆0．5%，尿素0．5%，氯化钠0．25%，灭菌前pH为7。在115℃灭菌15min。接种后在（32±1）℃，培养18h。

二级种子：培养基同一级种子，接种量为3%，（32±1）℃，通气量为1∶0．25，pH 6．4～6．6培养12～15h。

四、发酵

培养基配方为淀粉水解液10%，干酵母水解液1．5%，豆饼水解液0．5%，硫酸镁0．1%，氯化钾0．2%，磷酸氢二钠0．5%，尿素0．4%，硫酸铵1．5%，有机硅油（消泡剂）0．05%，pH为7。接种量为0．9%，（32±1）℃，通气量为1∶0．5，搅拌速度为320r／min，培养93h。

扩大发酵：培养基配方为淀粉水解液10%，干酵母水解液1．5%，豆饼水解液0．5%，硫酸镁0．1%，氯化钾0．2%，磷酸氢二钠6．5%，碳酸钙1%，硫酸铵1．5%，有机硅油（消泡剂）小于0．3%，pH为7。接种量为7%，（32±1）℃，通气量为1∶0．25，搅拌速度为230r／min，培养75h。

扩大发酵，培养基同上，接种量2．5%，（35±1）℃培养83h。

五、提取、吸附、洗脱

取发酵液，调pH为2．5～3，连同菌体通过两个串联的732氢型树脂柱吸附。用相当于树脂总体积3倍、pH为3的水洗1次，然后把两个柱子分开，用pH为3的水把肌苷从柱上洗脱下来。再经769型活性炭柱吸附肌苷，先用2～3倍体积的水洗涤，后用70～80℃的水洗，再用70～80℃、1mol／L氢氧化钠浸泡30min，最后用0．01mol／L氢氧化钠洗脱肌苷，收集洗脱液真空浓缩至1．170g／mL，pH为11或pH为6放置，结晶析出，过滤，得肌苷粗制品。

六、精制

取粗制品配成5%～10%溶液，加热溶解，加入少量活性炭作助滤剂，抽滤，放置冷却，得白色针状结晶，过滤，少量水洗涤1次，80℃烘干得肌苷精制品，收率为44%，含量为99%。