氨基酸的粗制

任务1　氨基酸的粗制

目前全世界天然氨基酸的年产量在百万吨左右，其中产量较大者有谷氨酸、甲硫氨酸及赖氨酸，其次为天冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。目前构成天然蛋白质的20余种氨基酸的生产方法有天然蛋白质水解法、发酵法、酶法及化学合成法等4种。氨基酸及其衍生物类药物已有百种之多，但主要是以20余种氨基酸为原料经酯化、酰化、取代及成盐等化学方法或酶转化法生产。

一、蛋白质水解法

蛋白质水解法生产氨基酸主要以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种氨基酸。

本法的优点是原料来源丰富。缺点是单一氨基酸在水解液中含量低，生产成本较高。目前仍有一些氨基酸用蛋白质水解法生产，如胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸等。

1．酸水解法

酸水解法是水解蛋白质制备氨基酸的常用方法。一般是在蛋白质原料中加入约4倍质量的6～10mol／L的盐酸或4～8mol／L的硫酸，于110℃加热回流10～24h，或加压下于120℃水解8～12h，使蛋白质充分水解后除酸，即得氨基酸混合物。

本法的优点是水解完全，不引起氨基酸发生旋光异构作用，所得氨基酸均为L型氨基酸。缺点是色氨酸几乎全部被破坏，含羟基的氨基酸部分被破坏，水解液呈黑色而需进行脱色处理，环境污染较严重。

2．碱水解法

碱水解法通常是在蛋白质原料中加入6mol／L氢氧化钠溶液，于100℃水解6h得氨基酸混合物。

本法的优点是水解时间较短，色氨酸不会被破坏，水解液不呈黑色。缺点是含羟基和巯基的氨基酸大部分被破坏，并引起氨基酸的消旋作用，产物有D型和L型氨基酸，环境污染也较严重，故本法较少采用。

3．酶水解法

酶水解法通常是利用胰酶、木瓜蛋白酶或微生物蛋白酶等，在常温、常压下水解蛋白质，制备氨基酸。

本法的优点是反应条件温和，氨基酸不被破坏且不发生消旋作用，对设备条件要求较低，环境污染较轻。缺点是由于蛋白酶常常对肽键具有选择性而使蛋白质水解不彻底，中间产物（短肽）较多，水解时间长，故主要用于生产水解蛋白和蛋白胨，在氨基酸生产上比较少用。但用两种以上的蛋白酶进行水解，可解决部分蛋白质水解不彻底的问题。

二、发酵法

氨基酸发酵法生产是指通过特定微生物在培养基中生长产生氨基酸的方法。本法的优点是能够直接生产L型氨基酸，原料丰富且价廉，环境污染较轻。缺点是产物浓度低，生产周期长，设备投资大，有副产物反应，氨基酸的分离纯化技术要求比较复杂。

氨基酸发酵法所用菌种主要为细菌、酵母菌，早期多为野生型菌株，20世纪60年代后则多用经人工诱变选育的营养缺陷型和抗代谢类似物突变株。自20世纪80年代开始，采用细胞融合技术及基因重组技术改造微生物细胞，已获得多种高产氨基酸重组菌株及基因工程菌。目前大部分氨基酸可通过发酵法生产，如谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸等，产量和品种逐年增加。

发酵法生产氨基酸的基本过程包括培养基配制与灭菌处理、菌种诱变与选育、菌种培养、发酵培养、产品提取及精制纯化等步骤。

1．氨基酸产生菌的选育

氨基酸产生菌最初是从自然环境中筛选得到的。但是，氨基酸作为微生物细胞中的基本组分，其生物合成受到严格的代谢调节控制，一般不能满足工业上大量生产氨基酸的需要。为了大量生产氨基酸，必须采取种种措施，以打破微生物对氨基酸生物合成的代谢调节控制。在氨基酸产生菌的菌种选育工作中常采用营养缺陷型突变和氨基酸结构类似物抗性突变来消除或减弱氨基酸终产物的反馈调节，使产生菌的代谢朝着有利于大量合成某种人们所需要的氨基酸的方向发展。

2．氨基酸的发酵生产

自1956年开始用发酵法生产谷氨酸以来，随着对氨基酸生物合成代谢及其调节机制的深入研究，人们进而采用人工诱变缺陷型和代谢调节突变株，使氨基酸发酵生产的品种不断增多，产量迅速增加，从而推动了氨基酸工业的发展。

1）培养基

工业微生物绝大部分都是异养型微生物，即在其生长和繁殖过程中需要诸如碳水化合物、蛋白质等一系列外源有机物质提供能量和构成特定产物需要的成分。

在氨基酸发酵培养基中，选择何种营养物质，采用何种浓度，取决于菌种性质、所产生的氨基酸种类和采用的发酵的操作方法。而在发酵培养基的各种成分与成分之间的配比是决定氨基酸产生菌代谢的主要因素，与氨基酸的产率、转化率及收率关系很密切。

（1）碳源

碳源是组成培养基的主要成分之一。其主要功能：一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳；二是为菌体合成目的产物提供所需的碳。

在氨基酸发酵中，常用的碳源有淀粉水解糖、糖蜜、甘薯粉、醋酸、乙醇、烷烃、石油醚等。

（2）氮源

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮的目的产物，还用来调节pH。常用的氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类。

①有机氮源。

在氨基酸发酵中，常用的有机氮源有玉米浆、豆饼水解液、尿素等。

②无机氮源。

在氨基酸发酵中，常用的无机氮源有铵盐、氨水等。

在氨基酸发酵中，不仅菌体生长需要氮，氨基酸合成也需要氮，因此氮源的需求量要比一般的发酵多。

（3）无机盐及微量元素

微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，需要某些无机盐和微量元素作为其生理活性物质的组成或生理活性物质合成时的调节物。

这些物质一般在低浓度时对微生物生长和目的产物的合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。而各种不同的微生物及同一微生物在不同的生长阶段对这些物质的最适需求浓度也不相同。

在氨基酸发酵中，常用磷、镁、钾、硫、钙和氯等元素的盐形式加到培养基中。而一些微量元素如钴、铁、铜、锰、锌、钼等，除氨基酸发酵特殊需要外，在一般复合培养基中无须另行加入。

①磷。

菌中含磷较多，磷酸化作用是糖代谢中的主要步骤之一。磷酸盐在培养基中具有缓冲作用。

②镁。

镁能刺激菌体生长，也称呼吸作用的接触剂，是很多酶促反应中的无机激活剂。

③硫。

硫是构成菌体细胞蛋白质的组成部分，也是参与合成含硫氨基酸的元素。

（4）水

水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。水除了直接参与一些代谢反应外，又是进行代谢反应的内部介质，还能调节细胞温度。

水的质量还将直接影响氨基酸发酵的质量。因为在不同的水源中存在的各种物质，对微生物发酵代谢会产生很大的影响，特别是水中的各种矿物质。

（5）生长因子

微生物维持正常生活所不可缺少而需求量又不大的一些特殊营养物，称之为生长因子。微生物的生长因子主要是一些维生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶。

在氨基酸发酵中，需要生物素作为其生长因子。如在谷氨酸发酵过程中，微生物菌体内生物素含量由“丰富向贫乏”过渡，而达到“亚适量”才能保证谷氨酸的积累。许多氨基酸生产菌的菌种都是从以糖为原料的谷氨酸产生菌诱变得来的。这些菌的性质和它们的亲株一样需要以生物素作为生长因子，因此生物素的供应对氨基酸发酵培养基来说是很重要的。

生物素的作用主要是影响细胞膜透性和代谢途径。

2）pH

氨基酸发酵所用菌种主要为细菌，其次为酵母。细菌生长的适宜pH一般在6．0～7．5之间，酵母的适宜pH一般在4．0～6．0的酸性范围内。

一般来说，处于菌体生长期的发酵液pH变化较大，因为菌体在利用营养物质时会释放一些酸性物质使pH下降；或释放一些碱性物质使pH上升。而处于产物合成期的发酵液pH相对稳定一些。

在氨基酸生产上，控制pH的方法一般有两种：一是流加尿素；二是流加氨水。流加的数量和时间则主要根据pH变化、菌体生长、糖耗情况和发酵阶段等因素来决定。

3）温度

微生物生长、维持及产物的生物合成都是在一系列酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件。不同的微生物菌种的最适生长温度和产物形成的最适温度都是不同的，控制发酵过程中的温度变化是保证得到最佳目的产物的必要条件。

选择某一微生物菌种发酵过程的最适温度，还要考虑其他发酵条件，灵活掌握。如当通气条件较差时，最适发酵温度可能比在正常良好通气条件下低一些。

氨基酸发酵所用的微生物菌种一般为中温菌，生长最适温度为20～40℃，过高或过低都会影响其生长。

由于氨基酸发酵是在菌体生长达到一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。

4）氧气

氨基酸发酵所用的菌种大都是好氧性菌种。好氧性微生物发酵时，主要是利用溶解在水中的氧，只有当氧到达细胞的呼吸部位时才能发生作用。所以增加培养基中的溶解氧，才能使更多的氧进入细胞，以满足代谢的需要。

微生物对氧的需求是不同的。在氨基酸发酵中，根据发酵时需氧程度的不同可分为3类。

（1）要求供氧充足

在谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸等氨基酸发酵时，在氧充足时产酸率最高。

（2）宜在缺氧条件下

在亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸等氨基酸发酵时，当菌体呼吸有一定程度受阻时，产酸率最高。

（3）对供氧要求不高

在赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等氨基酸发酵时，对氧的要求介于前两者之间。即在氧充分的情况下，产酸率最高；在供氧不足的条件下，产酸率有所下降，但下降不如第一种显著。

由上述可知，在进行氨基酸发酵时，必须根据氨基酸对氧的需求来控制发酵液中的溶解氧。

5）氨基酸发酵的代谢控制

微生物在进行物质的吸收和排出、分解和合成以及放能与吸能等一系列复杂的新陈代谢过程中，会引起微生物机体内外物质的变化，而这种物质的变化过程就称为物质代谢。微生物通过氧化有机物质如葡萄糖和其他碳水化合物，获得能量的反应属于分解代谢。获得能量后合成自身新物质的反应属于合成代谢。

不同种类的微生物因环境不同所引起的物质代谢过程以及代谢的产物也有差别。

三、酶法

酶法也称酶工程技术、酶转化法，实际上是在特定酶的作用下使某些化合物转化成相应氨基酸的技术。其基本过程是利用化学合成法、生物合成法或天然存在的氨基酸前体为原料，同时培养具有相应酶的微生物、植物或动物细胞，将酶或细胞进行固定化处理，再将固定化酶或细胞装填于适当反应器中制成所谓的“生物反应堆”，加入相应底物合成特定氨基酸，反应液经分离纯化即得相应氨基酸成品。

酶法与直接发酵法生产氨基酸的反应本质相同，皆属酶转化反应，但前者为单酶或多酶的高密度转化，而后者为多酶的低密度转化。

本法的优点是产物浓度高、副产物少、成本低、周期短、收率高，固定化酶或细胞可连续反复使用，节省能源。目前使用该法生产的品种有天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、异亮氨酸等。

四、化学合成法

化学合成法通常是以α－卤代羧酸、醛类、甘氨酸衍生物、异氰酸盐、卤代烃、α－酮酸及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩合、取代、加氢等化学反应合成α－氨基酸。化学合成法是制备氨基酸的重要途径之一，但氨基酸种类较多，结构各异，故不同氨基酸的合成方法也不同。

本法的优点是可采用多种原料和多种工艺路线，特别是在以石油化工产品为原料时，成本较低，生产规模大，适合工业化生产，产品易分离纯化。缺点是有些氨基酸的合成工艺复杂，生产的氨基酸皆为消旋体，需经拆分才能得到人体可利用的L型氨基酸。甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸等用化学合成法生产。