细胞突变体的诱发和筛选

1）细胞突变体的诱发和筛选的基本程序（见图6.1）

（1）预处理（制备单细胞）。①材料选择。用于突变体筛选最理想的材料为单细胞或原生质体。也可用茎尖、腋芽等，但容易诱发嵌合体。由于单细胞或原生质体再生成植株的植物种类仅限于少数，因而在使用上受到限制。为此，目前用得最多的材料是愈伤组织。首先，愈伤组织是介于单细胞和具有一定结构的组织之间的组织；其次，愈伤组织是分生细胞，容易诱发突变；再次，愈伤组织分散性好，借助酶处理分散性更好。②预处理。采用诱变剂进行化学诱变处理，根据植物种类需对诱变剂的浓度、处理时间进行筛选，选用最适浓度、最适处理时间方可收到良好的效果。例如：烟草高蛋氨酸突变体的筛选。以EMS（甲基磺酸乙酯）为诱变剂，浓度为0.25%，预处理时间为1 h；而水稻高赖氨酸突变体的筛选以EMS为诱变剂，浓度为1%，预处理时间为1 h。③制备细胞悬浮液。经预处理的材料用糖液洗净备用。如材料是愈伤组织，需借助酶处理。同样经过过滤、离心沉降，最后获得纯净的细胞悬浮液。

图6.1　植物细胞突变体诱发和筛选程序

（2）预培养。单细胞或愈伤组织经诱变剂处理和酶处理后活力下降，为恢复细胞活力必须进行预培养。预培养可采用平板培养法，亦可采用悬浮培养法，无论采用哪种方法均需考虑细胞起始密度。

预培养时间因植物种类而异。如烟草平板培养法，预培养2周。水稻悬浮培养法，预培养10天。

（3）反馈诱发突变。诱发突变一般采用平板培养法，并在培养基中加入某种选择因子，反复饲喂培养植物细胞，使其发生拟定目标的突变，一般需数月时间。

（4）高抗、高产细胞株的选择。将在具有选择因子的培养基中培养数月的细胞团，转入不加选择因子的培养基中培养，脱除选择因子。经数周后再转入具有选择因子的培养基上，培养数周后选择能旺盛分裂的细胞团（细胞株），说明该细胞团是具有抗相应选择因子的突变细胞株。

（5）细胞增殖与器官建成。如果采用的材料是单倍体细胞，则可在分化培养基中，加入秋水仙素，诱发染色体加倍。分化出来的植株是正常可育二倍体。如果采用的材料是原生质体，尚需按原生质体培养程序，诱导细胞壁再生，然后器官分化，植株再生。如果采用的是体细胞愈伤组织，则按正常的方法诱导愈伤组织分化，植株再生。

（6）突变株系的鉴定和遗传分析。主要根据诱发突变目标进行生化分析；细胞学观察和田间性状观察等分析突变是属于遗传的变异（基因突变），还是属于非遗传的变异（表型变异）。

2）诱变剂及其作用

随着体细胞无性系变异在育种中的应用，人们已不能满足于自然发生的变异频率，于是就通过一些化学和物理的手段诱导变异发生，并从中筛选出具有期望性状的植株。因诱发突变包括物理诱变和化学诱变。所以诱变剂也包括物理诱变剂和化学诱变剂。

（1）常用的物理诱变剂。主要为各种射线，包括X射线、γ射线、中子（快、慢、热中子）、α粒子、β粒子、紫外线等（见表6.4）。

表6.4　常用的物理诱变剂（Sparrow，Konzak，1958）

紫外线是使用最广泛、最有效的诱变剂，在无菌条件下（超净工作台）用紫外灯照射处理即可。但应注意为避免DNA的光修复、降低诱变频率，紫外线处理后必须在黑暗条件下培养。

（2）常用化学诱变剂。主要有烷化剂、天然碱基结构类似物、叠氮化合物、吖啶类染料等。

烷化剂。这是一类含有一个或多个活化烷基的化合物，如N—甲基—N′—硝基—N—亚硝基胍（NG，NTG或MNNG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、乙烯亚胺（EI）、硫酸二乙酯（DES）、亚硝基甲基脲烷（NMV）和N—乙基—N—亚硝基脲（NEV或ENU）等。它们能与DNA分子中的碱基或磷酸基结合，使之烷化，引起像天然碱基类似物一样的碱基错误配对，从而导致变异。

天然碱基结构类似物。如5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿嘧啶（Bucr）、2-氨基嘌呤（AP）和马来酰肼等，此类物质能掺入DNA分子中，使DNA在复制过程中发生碱基交换（GC→AT→GC）。

叠氮化合物。如叠氮化钠（NaN3），这是一种有效诱变剂（对植物诱变效果最好），能获得很高的突变体频率（诱变率为40%～50%或70%）。诱发的大部分是基因突变，极少数为染色体异常。它诱变力强，且较安全，无持续性，处理方便。

吖啶类染料。如原黄素、吖啶橙、5-氨基吖啶和溴化乙啶等，均为有效的移码突变剂。它们能嵌入DNA分子中间，使一对（或少数几对）核苷酸增加或缺失，从而造成移码突变。

其他。如羟胺（能与DNA分子中的胞嘧啶起作用）、亚硝酸（能使DNA碱基脱除氨基）等。