实验九 拟南芥T-DNA插入突变体的筛选——植株表型分析和鉴定
【实验目的】
1.通过本实验使学生掌握转基因植株外部形态观察的方法。
2.掌握在细胞和组织水平上鉴定转基因植株的方法。
【实验原理】
相对于野生型植株而言，转基因植株在外部形态、细胞和组织结构、代谢水平等方面均可能产生一定的变化。转基因植株的这些变化往往是由基因表达和细胞组织水平上的代谢变化所造成的。
【实验材料】
拟南芥野生型植株及转基因植株。
【实验器材】
冰冻切片机，普通显微镜，荧光显微镜，冰箱，培养箱等。
【实验方法】
下面列出的是正常野生型拟南芥和突变体的外部形态。
1.种子
拟南芥成熟的野生型种子仅0.3～0.5mm长，20～30μg干重，种子椭圆形，饱满，棕色。种子的大小随生长条件和遗传背景不同稍微有所变化。
常见种子的异常表型有:
(1)对称、圆形、长椭圆形、枯萎状。
(2)大小:偏大、偏小。
(3)颜色:咖啡色、浅棕色、黄色、绿色、白色。
(4)质地:光滑的、皱纹的。
(5)育性:坏死的、半育的。
(6)萌发:早萌发、晚萌发、不萌发。
2.子叶
常见子叶的异常表型有:
(1)数目:没有、一个、三个、三个以上。
(2)大小:不对称、比一般大、比一般小。
(3)颜色形状:闭合状、白化状、呈现表皮毛。
(4)子叶的叶柄:颜色异常、形状异常(如呈钩状或呈扭曲状)、大小异常(长度、直径)、出现坏疽。
(5)衰老过快或过慢。
3.下胚轴
常见异常表型有:
(1)数目:多个或缺失。
(2)长度:过长或过短。
(3)颜色:各种异常颜色。
(4)形状:形状异常(如呈弯曲状)。
拟南芥幼苗下胚轴的生长受很多环境信号以及植物内部发育进程的影响，如光照、激素等。通过观察下胚轴的生长状况，可以筛选出于环境信号、激素信号有关的突变体。
4.根
根据发育的先后顺序，拟南芥的根可以分为初生根和次生根。
常见初生根的异常表型有:
(1)根系大小:偏小、偏大。
(2)数目:缺失、多于一根。
(3)尺寸:直径粗或细、长度长或短。
(4)形状:根的角度异常、没有向地性、波浪形根、璞形、螺旋形、缠绕形。
(5)颜色:各种颜色的变化。
(6)根毛:颜色异常、长度异常、间距大小异常、数目异常、根毛缺失。
常见次生根的异常表型有:
(1)尺寸:更长、更短。
(2)形状:直的、螺旋形、有分岔的、更粗、更细。
(3)颜色:不同颜色的变化。
(4)间距:更密，更宽。
(5)数目:多、少、缺失。
(6)侧根数目:偏多、偏少、无侧根。
(7)根毛:颜色异常、长度异常、分布异常、数目异常、缺失。
根的生长较容易测定，对根尖生长的测定可以表明生长活性。根生长可以用很多方法进行测量，最简单的方法是将拟南芥生长在培养皿中，在一定时间记录根尖的位置，根长度的增加可以用尺度量，并输入计算机用软件(NIH-image)进行分析。
由于拟南芥根尖取材方便，结构简单，是目前研究生长素信号转导、细胞分裂等问题的良好材料。
5.茎
常见茎的异常表型:
(1)株高:偏高、偏矮。
(2)生长速度:快、慢。
(3)大小:偏粗、偏细。
(4)颜色:各种异常颜色。
(5)结构:融合状、柔软的、波浪状、多节或多分支的、丛生。
(6)茎节间距:偏大、偏小、变化的。
(7)茎生叶:多、少。
(8)分支:数目多或少、颜色异常、分支角度偏大或偏小、长度偏长或偏短、大小偏粗或偏细。
(9)顶端优势:非常明显、不明显。
6.叶
莲座叶常见异常表型:
(1)数目:偏多、偏少、无莲座叶。
(2)大小:偏大、偏小。
(3)衰老速度:快、慢。
(4)颜色异常:苍绿色、黑绿色、花青色。
(5)叶柄:长叶柄、短叶柄。
(6)生长部位:偏上性、偏下性。
(7)形状:圆叶、窄叶。
叶子的整体形态的异常表型:
(1)大小:偏大或偏小。
(2)叶原基有缺陷。
(3)叶间距:偏大或偏小。
(4)衰老叶子的数目:多或少。
(5)叶子萎蔫。
(6)叶序:异常。
(7)叶子与枝条的交角:偏大或偏小。
叶柄的异常表型:
(1)颜色:各种异常的颜色。
(2)形状:螺旋状、顺时针弯曲、逆时针弯曲。
(3)叶柄融合。
(4)尺寸:长度偏长或偏短、直径偏大或偏小。
叶片的各种异常表型:
(1)颜色:各种异常颜色。
(2)形状:圆的、尖的、平的、向上弯曲、向下弯曲。
(3)坏疽覆盖率: 25%、50%、75%。
(4)尺寸:偏大或偏小、偏长或偏短、偏宽或偏窄。
(5)叶中脉:颜色异常、直径偏大或偏小、位置偏左或偏右。
(6)叶脉:颜色异常、纹路异常、大小异常。
7.花
常见花的异常表型:
(1)花的数目:偏多、偏少。
(2)开花时间:早开花、晚开花、不开花。拟南芥从营养生长向生殖生长过程中，叶原基转变为花原基。开花时间的长短可用不同标准来衡量，可以选择刚刚在茎顶端看到花芽的天数，也可以取第一朵花开放的时间，也可以用主茎抽苔1cm的时间。同时，由于开花所需要的天数与某一条件下生成的叶片数目之间存在着相关性，因此，也可以以叶片数目来确定开花时间。
(3)形状:呈融合状。
(4)雄性不育。
(5)花梗:长度偏长或偏短、与茎的交角偏大或偏小、呈融合状。
(6)萼片:数目偏多或偏少、颜色异常、形状扭曲的、大小偏大或偏小、偏长或偏短。
(7)花瓣:数目偏多或偏少、颜色异常、形状大小、长短异常或不规则。
(8)雄蕊:数目偏多或偏少、颜色异常、形状异常。
(9)心皮:数目每个雌蕊多一个或少于一个、颜色异常和形状异常。
8.角果
常见角果的异常表型:
(1)数目:偏多或偏少。
(2)大小:偏长或偏短、偏粗或偏细。
(3)无种子或很少的种子。
(4)形状:弯曲的、不均匀的宽度、融合状的。
(5)颜色:各种异常颜色。
(6)母体发芽。
9.胚胎发生
常见胚胎发生的异常有:
(1)顶基模式缺失突变:顶部区缺失、中央区缺失、基部区缺失和末端区缺失。
(2)径向模式缺失突变:三种组织(表皮、基本组织和维管细胞)的缺失或异常。
(3)形状改变突变体:幼苗各种形态的异常。
10.激素反应
植物对于各种激素都有自己的信号传递系统，这些信号传递系统在植物生长和发育过程中发挥着重要作用。筛选与激素反应相关的突变体可以通过在培养基中施加激素，观察突变体与野生型生长状态的不同来实现。
11.胁迫反应
可以根据各种胁迫条件下的不同反应，筛选出与胁迫有关的突变体。
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