原生质体融合方法

诱导分离的原生质体融合主要有机械融合法、化学融合法和电融合法3种方法。

（2）高pH－高浓度钙离子融合法。一般情况下，与钠离子和钾离子比较，钙离子影响细胞融合的效率是很低的，但是在高p H环境中高浓度钙离子会诱发融合效应。这种方法是凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers）1973年为了融合两种不同的烟草原生质体发明的，现在被普遍使用。其方法是将分离的两个品系的烟草叶肉原生质体，混合在融合诱导缓冲液（0.05 M CaCl2，0.4 M甘露醇溶液，0.05 M甘氨酸－NaOH缓冲液，p H10.5）中，50 g离心30 min，在37℃水浴温育。原生质体马上聚集，在10 min内发生融合，融合率可以达到10%；水浴中温育40～50 min后，原生质体融合率可以达到20%～50%，图5.10为高pH－高浓度钙离子原生质体的融合过程。但是这种方法仅适合叶肉原生质体的融合。

1）机械融合法

分离的原生质体在显微操作仪下产生紧密的物理接触而融合。

2）化学融合法

用化学物质促使原生质体融合，如：NaNO3、Ca2+、聚乙二醇（PEG）和二甲亚砜（Me2SO）等。化学融合剂引起分离的原生质体彼此黏附，导致紧密黏着产生融合。化学融合是一种非特异性、费用低的、能够产生大量融合产物的融合方法，但是这种方法缺点是可能对细胞有毒、非选择性和融合效率低。

（1）NaNO3融合法。1970年Power等第一次描述了用0.25 M NaNO3作为融合剂伴随离心促进玉米与燕麦原生质体融合。1972年，美国研究者卡尔森（Carlson）等采用0.25MNaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界第一株体细胞杂种。

NaNO3诱导原生质体融合的机理是钠离子能中和原生质体表面的负电荷（－10～－30 mV），使原生质体不再相互排斥，凝聚原生质体，使原生质体质膜靠近而融合。但是这种方法的融合率低（0.1%～4%），产生很少的异核体，并且原生质体的吸收能力改变。

钙离子中和原生质体膜或细胞膜表面电荷，使聚集的原生质体的膜紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性，高p H能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。很多种间和种内的体细胞杂种就是使用这种方法产生的。值得注意的是，钙离子浓度和p H范围因植物种类不同而异。这种方法的高p H值或许对有些细胞是有毒的。

（3）葡聚糖、聚乙烯醇（PVP）合成的磷脂用作细胞融合。1975年，Kanega用不同浓度的甘露醇处理烟草原生质体获得了20%以上的融合率；1978年，Nagata用15%聚乙烯醇+0.05 mol/L氯化钙+0.3 mol/L甘露醇组成的融合剂，成功地将烟草与大豆、烟草与萝卜等原生质体融合。

图5.10　高pH－高Ca2+下的原生质体融合

（4）PEG融合法。20世纪70年代初，华裔科学家高国楠发现聚乙二醇（PEG）能促使植物原生质体融合。PEG是一种大分子（分子量1 000～6 000）的水溶性的多聚化合物。一般28%～50%的PEG溶液用于细胞融合。因为PEG液比病毒更易制备和控制，其活性稳定、使用方便，而且促进细胞融合的能力更强，因此，在化学药品融合剂中，PEG作为细胞融合剂应用最为广泛，可以诱导高频率的异核体形成。

影响PEG融合法的因素有PEG的种类、纯度、浓度、处理时间及原生质体的生理状况和密度等。其中，PEG的分子量和浓度在成功诱导融合中起关键作用。分子量小于100的PEG不会产生紧密的粘连，然而分子量为6 000的PEG在诱导融合时是非常有效的。但是，较高分子量的PEG会产生太黏的溶液而不容易被操作。低温（10℃）比常温（25℃）下培养的原生质体融合的速度加快。近年来一些研究建议在PEG溶液中加入融合促进剂（伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜、链霉蛋白等），可有效提高原生质体的融合频率。

（5）PEG结合高pH－高浓度钙离子融合法。20世纪70年代中期，Kao等建立了PEG－高pH－高钙法。直到20世纪90年代，所获得的体细胞杂种大部分是用这种方法诱导融合产生的，是最有效的融合方法。其作用机理是，在高Ca2+和高p H溶液的作用下，将高钙离子与质膜结合的PEG分子洗脱，进一步加剧电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体，从而提高融合概率。

3）电融合法

电融合法是20世纪80年代初迅速崛起的一种细胞融合方法，也是目前最流行的物理诱导融合方法。电融合法有2个步骤：①原生质体悬浮液在两极间施加高频交流电场（一般为0.4～1.5 MHz，100～250 V/cm），使原生质体偶极化而沿电场线方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；②再用一次或多次瞬间高压直流电脉冲（一般为3×10μs，1～3 k V/cm）来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体（见图5.11）。该方法对细胞没有毒害作用，并且操作简便，融合同步性好，可在显微镜下观察融合的全过程，整个过程中的参数容易控制。至今已广泛应用于动植物及微生物细胞的融合。影响电融合效果的因素主要是电压大小、持续的时间和原生质体的尺寸。

图5.11　原生质体电融合过程