肿瘤抑制基因的发现

前面几节关于癌基因的讨论表明，癌基因在肿瘤发生的作用是因为其编码的蛋白产物的活性增加或结构改变能导致细胞的恶性转化，无论是突变还是致瘤病毒在细胞的基因组引入的癌基因都呈现出对野生型原癌基因的显性效应，即激活单个等位基因就可能致癌，或者说致瘤性是因为发生了突变的原癌基因获得了一种新的功能。那么，是不是能引起癌变的基因突变都是显性突变呢？隐性突变是不是也有可能引起细胞的恶性生长呢？可以设想，如果细胞因某种基因的隐性突变而成为癌细胞，那么这种癌细胞与正常细胞融合后的表型应该是正常的，不会呈现出恶性转化特性。在肿瘤分子生物学发展的早期，盖泽（A.G.Geiser）等就通过细胞融合和基因转染实验证实的确存在致癌的隐性突变基因。

美国儿科医师努森（A.G.Knudson）注意到，在儿童期发生的有强烈遗传倾向的恶性病变中最常见的是视网膜母细胞瘤。他发现多数患儿单眼患瘤，但也有患儿双侧眼睛都患瘤，甚至还有在极早期就出现双侧视网膜母细胞瘤的病例。在基因型分析中，努森发现患儿及其部分家族成员的染色体13q14区段有一个与视网膜母细胞瘤发病关联密切的基因突变，这个基因就被命名为Rb。患者的致病基因，即Rb的突变等位基因rb，既可以是通过生殖系遗传而使患者在家族内聚集，也可以通过体细胞突变而使病例呈散发状态。但是大量的临床资料表明，只有该基因座位上的两个等位基因的功能都丢失时才会致癌。有家族性病史或双侧发病的病例往往携有一个通过生殖系遗传的突变等位基因rb，而另一个基因是野生型等位基因Rb，其基因型为Rb/rb（表8-5）。一旦体细胞中的Rb突变为rb就会导致肿瘤，所以肿瘤组织的基因型是rb/rb。临床资料和遗传分析都提示视网膜母细胞瘤是隐性突变而引发的肿瘤，视网膜母细胞瘤也成了临床上发现的第一个隐性突变致癌的实例。

表8-5视网膜母细胞瘤的基因型

注：Rb＋为野生型基因；rbˉ为突变型基因；-为染色体缺失。

根据视网膜母细胞瘤的发病机制，早在20世纪70年代努森就提出了视网膜母细胞瘤致病的“两次打击”假设。他认为患者家族中携带了一个突变基因rb的成员会在极早期通过基因点突变、染色体的丢失、缺失、不等交换、细胞的有丝分裂重组，或者染色体丢失加重复等机制而失去仅存的野生型等位基因Rb，最终造成早期双侧肿瘤（图8-14a）。他还注意到没有家族史的散发病例一般发病较晚，还常常只是单侧患瘤。值得注意的是无论通过什么机制，经历两次打击的肿瘤组织使最初因Rb和rb两个基因共存而呈现的遗传异质性丢失（loss of heterozygosity，LOH）。此后，分子生物学家利用基因的限制性内切酶的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）实验发现，视网膜母细胞瘤细胞的相应片段确实呈现出LOH，从而也证实了努森“两次打击”假设（图8-14b）。这样努森不仅发现了人的一个特定基因的隐性突变与一种恶性肿瘤之间的关联，还建立了细胞恶性转化的两次打击学说。由此可以推断视网膜母细胞瘤的发病原因是Rb基因的突变造成了它编码的蛋白质功能的缺失。此后，研究还提示Rb基因的功能缺失与骨肉瘤和小细胞肺癌的发生、发展有密切关联。后来人们又陆续发现了多种隐性突变引起的肿瘤（表8-6），进一步证实基因的隐性突变可以引起人恶性肿瘤。

图8-14　（a）两次打击造成肿瘤细胞LOH的可能机制：（b）利用RFLP诊断LOH的原理

图中具有诊断价值是限制性内切酶Msp Ⅰ切割片段的长度。在野生型等位基因Rb和突变型等位基因rb共存时会出现两条长度不等的Msp Ⅰ切割片段A和B，一旦野生型等位基因丢失，不论Rb和rb的Msp Ⅰ切割片段是A还是B，结果只能是与rb对应的Msp Ⅰ切割片段一样长度的DNA片段。

表8-6　人肿瘤中的隐性突变实例

Rb基因编码的蛋白质RB是影响细胞周期的核内磷酸蛋白RB，在细胞周期的休止期（G0/G1），RB是非磷酸化的，而在细胞分裂期，特别是G1期末它可被细胞周期素依赖性激酶（cyclin dependent kinase，Cdk）/细胞分裂周期素复合物（cyclin complex）磷酸化，在有丝分裂中又被去磷酸化。非磷酸化的RB可特异性地与多种蛋白质结合，所以RB和这些蛋白质的相互作用只能发生于S期之前，一旦RB被磷酸化，则会释出这些蛋白质。RB的下游靶基因包括转录因子群E2F，E2F转而激活对细胞进入S期至关重要的一系列靶基因。与RB的结合则会抑制E2F激活转录的能力，这就提示RB可能会阻遏依赖E2F的基因的表达，即RB间接抑制了细胞进入s期。也就是说RB-E2F复合物直接抑制了某些靶基因，而RB-E2F复合物的解联可使这些基因得以表达（图8-15）。

我们是从病毒及其携带的v-onc开始讨论癌基因的，然而，对病毒致癌机制的深入研究却是以肿瘤抑制基因的功能分析为契机的。著名的肿瘤分子生物学家哈洛（E.Harlow）、怀特（P.Whyte）和温伯格等的早期合作研究就发现了猴病毒SV40的T抗原和腺病毒的E1A抗原能特异性地和非磷酸化的RB蛋白结合。非磷酸化的RB蛋白一旦和肿瘤病毒的特异性抗原结合就不能再与E2F结合，E2F由此摆脱了RB蛋白，进而促使细胞进入S期。除此之外，非磷酸化的RB蛋白对癌细胞增殖的阻遏作用还可以通过转基因实验来说明。有人曾经分离到一株RB蛋白缺乏的骨肉瘤细胞，当将Rb基因转入该细胞株后其生长就很快被阻止。然而，这种阻止可以被细胞周期素D的高表达所克服，因为细胞周期素D也能形成Cdk/细胞周期素复合物而使RB蛋白磷酸化而释放出E2F，导致细胞增殖加快。病毒抗原与RB蛋白的特异性结合与肿瘤发生的关联也进一步证实了肿瘤抑制基因对细胞分裂的调控作用。此外，涉及细胞周期G0/G1或G1/S调控的还有小分子抑制蛋白p16、p2l和p27等。

图8-15　转录因子E2F、细胞周期素复合物Cdk和RB蛋白的磷酸化的关系及其对细胞分裂的影响（引自sunmoonx.blogsprt.comm网）

近50年的研究表明，与肿瘤发生相关联的隐性突变基因绝大多数是肿瘤抑制基因（tumor suppressorgene），又称抗癌基因（anti-oncogene），它们是保护细胞、使细胞避免走向癌症发展的某一阶段的一类基因。这类基因的突变或功能丢失会降低甚至完全丧失对细胞的保护功能，有可能在另一些肿瘤相关因子的协同作用下导致细胞进入恶变的进程。

定位于人染色体17p13.1的TP53基因编码了又一个重要的肿瘤抑制蛋白，即分子量为53 000的p53蛋白。p53蛋白是重要的转录因子，它由三个结构域组成：酸性的氨基端是转录活性结构域；富含碱性氨基酸的羧基端含有四聚体化结构域和核定位信号序列；中央含几个疏水性很强和带电荷极少的与DNA特异性结合相关的结构域。野生型p53对细胞增殖起一定的减速、检测损伤和监视作用，一旦发现尚未修复的损伤，则会导致细胞凋亡。几乎在50%以上的恶性肿瘤中都可以检查出p53突变，突变型p53蛋白丧失了对细胞生长、损伤监测、凋亡和增殖的调控作用，甚至会获得类似癌基因的新功能。经生殖系细胞遗传的p53突变基因可增大多种癌症的发病风险。

p53蛋白主要分布于细胞核，具有与DNA特异性结合的能力，它介导的细胞信号通路在细胞正常生命活动中有至关重要的作用，并且与其他的信号通路之间有广泛而复杂的联系，许多基因的表达直接或间接受它调控，它的活性还会因磷酸化、乙酰化、甲基化和泛酸化等翻译后修饰而改变。野生型p53通过对诸多基因的调节，或者直接与其他蛋白相互作用来调控细胞凋亡、抑制细胞周期和DNA损伤修复，以应对紫外光或其他射线的辐射、化学物质、低氧微环境等引起的细胞应激。

p53蛋白的关键性调控因子是泛素连接酶MDM2，它既能抑制p53的转录，又能靶向性地使p53蛋白泛酸化而导致其降解。另一方面，MDM2也会经自身泛酸化而降解，这样就会使MDM2和p53都能快速周转。因为MDM2同时也是p53转录产物的靶标，所以p53活性增加会导致其自身负调控因子MDM2的表达。这样，这两种分子在整个调控网络中维持着一个相互制约的负反馈回路。哺乳动物细胞中p53蛋白在非应激情况下仅维持较低的丰度，且半存活期较短。在应激条件下，p53蛋白可通过磷酸化或乙酰化等共价修饰，甚至改变它的细胞定位而趋于稳定，以提高在细胞中的丰度。活化的p53蛋白是高效的转录因子，能借助不同的信号转导通路介导细胞增殖周期阻遏、细胞凋亡、遗传损伤修复和抑制肿瘤的血管生成（图8-16）。

p53阻遏细胞增殖主要发生于细胞周期的G1/S对受损DNA的检测。p53的下游靶基因细胞周期依赖激酶抑制蛋白p21CIP1（cyclin dependent kinase inhibitor）可与一系列细胞周期素依赖性激酶（cyclin dependent kinase，Cdk）/细胞分裂周期素复合物（cyclin complex）相结合，阻遏其参与Rb的磷酸化，而非磷酸化的Rb能保持与转录因子群E2F的结合，使之无法激活细胞增殖相关的基因群，将细胞阻滞在G1期。p53的另一些下游基因，如DNA损伤修复蛋白GADD445、14-3-3α等也参与了对细胞增殖的调控。当DNA的损伤不可修复时，p53就会启动涉及特定的细胞死亡受体Fas和DR5，以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（aspartate-specific cysteine proteases）等细胞凋亡效应因子参与的细胞凋亡级联反应（caspase cascade）相关程序。泛酸化的p53还能移入线粒体直接诱导促凋亡蛋白Bax和Bak寡聚化，以拮抗抗凋亡因子Bc12和Bcl-xl等的作用。p53的DNA特异性结合结构域具有核酸内切酶活性，能切除错配的核苷酸，与其他修复因子协同参与受损DNA的修复。图8-16还显示了p53参与抑制肿瘤的血管生成和诱导细胞衰亡等调控作用相关的信号通路。

图8-16　p53的功能性结构区域、主要负调控回路及其激活的下游靶基因涉及的多条信号通路和相应的细胞效应示意（改自J.D.Amaral等）

虽然p53和Rb都是肿瘤抑制基因，但是它的功能受阻或丢失并不通过两次打击模式，突变型p53是以显性负效应（dominant negative）方式行使功能的，即它的突变基因编码的蛋白产物能阻遏野生型基因编码的蛋白质的功能。大量分析表明，人类癌症中发现的95%以上的p53突变都发生于它的DNA特异性结合区，且绝大多数属于错义突变。所以突变型p53基因虽然编码了全长的蛋白质，却不能激活下游的靶基因。除了功能丢失之外，突变型p53蛋白还呈现出抑制野生型p53蛋白的显性负效应，或者获得不依赖野生型p53蛋白的新功能。为了深入研究这种显性负效应，威利斯（A.Willis）等专门建立了三个特殊的细胞系：能单独诱导表达错义突变型p53蛋白的细胞系、能单独诱导表达野生型p53蛋白的细胞系和能同时诱导表达野生型p53蛋白和错义突变型p53蛋白的细胞系，并利用这三个细胞系比较系统地研究了突变型p53蛋白的显性负效应。实验提示错义突变型p53蛋白明显降低了野生型p53蛋白与其靶基因p21、MDM2和PIG3的反应元件的结合能力，从而也降低了对这些内源基因和其他靶基因的诱导，进而阻止了野生型p53蛋白对细胞周期的调控作用。这项研究证实错义突变型p53蛋白通过阻断野生型p53蛋白与DNA的特异性结合，随之阻止其抑制细胞生长等功能，呈现出突变基因的显性负效应。最近的研究还提示突变型p53蛋白还可能通过磷酸化、乙酰化或泛酸化等修饰改变分子的稳定性和空间构型，影响它在细胞内的丰度和显性负效应的强度。其实，只要p53蛋白的突变位置不一样，与之结合的转录因子等蛋白质种类就可能不一样，就有可能通过不同的机制导致程度不等的显性负效应。

此外，肿瘤抑制基因的功能丧失还可通过其他途径来实现，如细胞周期抑制蛋白p27kip 1的突变基因编码的蛋白呈现功能上的单倍性不足性（haploinsufficiency），即单个等位基因突变只是增加细胞对致癌的敏感程度。再如，与乳腺癌和卵巢癌密切关联的肿瘤敏感基因BRCA1的突变型等位基因可借助表观遗传机制控制特异性小RNA的表达来导致乳腺癌和卵巢癌的发生，我们将在表观遗传和肿瘤一节中做进一步讨论。图8-17是几种造成肿瘤抑制基因功能丧失机制的示意图。

细胞周期汇聚了细胞精确复制的关键步骤。与细胞癌变相关的突变事件大多发生于编码细胞周期调控信号分子的基因，主要是癌基因和肿瘤抑制基因。正常的细胞分裂受原癌基因调节，这对于生长发育和细胞的新老交替是必需的，而肿瘤抑制基因是细胞从G1期向S期过渡时的制动信号，必要时可使细胞分裂停止或减速。DNA损伤修复基因的重要作用是确保从S期进入染色体有丝分裂前的G2期的基因结构是完整的、没有受损的。DNA损伤修复基因的突变会增加癌症发生的风险，如遗传性非息肉结直肠癌相关基因（hereditary non polyposis colorectal cancer，HNPCC）、多发性内分泌腺瘤致病基因1（multiple endocrine neoplasia typel，MEN1）和乳腺癌易感基因（hereditary breast-ovarian cancer syndrome，BRCA1/2）等基因的突变会降低DNA修复效率，增加基因突变率，甚至导致其他肿瘤抑制基因失活或癌基因激活。所以DNA损伤修复基因也可归入肿瘤抑制基因。为了机体的整体利益，细胞还会启动凋亡程序来去除损伤未被修复的细胞。总之原癌基因的突变使细胞获得某种促进细胞周期进行和抑制细胞凋亡的能力，肿瘤抑制基因的突变则使细胞丧失控制细胞增殖和促进细胞凋亡的能力。图8-18显示这几类基因在细胞周期检测关卡点（checkpoint）调控中的作用及其相互关系。

图8-18上部是原癌基因、肿瘤抑制基因和DNA损伤修复基因对细胞分裂细胞周期检测关卡点的调控作用示意图，下部的表格列出了细胞原癌基因和肿瘤抑制基因突变对其功能的影响。