操纵基因和操纵子

在实验过程中，雅各布和莫诺分离到一种新的LacI基因突变，与J.莱德伯格分离到的LacIˉ突变相反，这种突变使细胞在诱导物存在时，也不能合成β半乳糖苷酶等三种诱导酶，称为LacIs突变。雅各布和莫诺用实验证实LacIs编码产生的阻遏蛋白失去了和诱导物结合的能力，致使在诱导物存在时，仍然阻遏诱导酶的合成。所以LacIs突变也是一种调节基因突变，其突变产物即变异的阻遏蛋白始终是与阻遏作用靶标结合在一起的。

雅各布和莫诺称阻遏物作用的靶标为操纵基因（operatorgene），它是能够与阻遏物发生特异性结合的一段DNA，对Z、Y、A三个基因的表达调控有多效性。重组分析表明，Z、Y和A三个结构基因是紧密连锁的，而I基因虽然与Z基因非常接近，但并不直接相连，所以就有理由假定操纵基因LacO介于LacI和LacZ之间。可以预期，LacO的突变会改变它与阻遏物结合的亲和力，也可能完全丧失与阻遏物结合的能力。当操纵基因LacO和阻遏物的亲和力消失时，这个LaCO的突变型对Z、Y、A来讲都是组成型，所以可称为LacOc。当LacO突变导致它与阻遏结合后不能分开，则会是一个经诱导也不能表达Z、Y、A的三重酶缺陷型，称为LacO0。

不久，雅各布和莫诺确实分离到了LacOc和LacO0两种突变，经杂交重组和连锁分析发现，LacO和LacI是不等位的，LacO0突变型细胞的LacI＋基因的表达是正常的。

必须指出，LacI-和LacOc两种突变虽然都能使三种诱导酶成为组成型表型，但当LacI-与相对应的野生型杂交时，LacI-对野生型基因LacI＋呈隐性；而LacOc与相对应的野生型杂交时，LacOc对LacO＋呈显性，说明两者的作用机制是不一样的。尤其值得注意的是，LacO只能调控位于同一DNA分子上的结构基因，而LacI对结构基因的调节要通过它所编码的阻遏蛋白，所以没有位置效应。表1-7汇总了各种有代表性的突变型的基因型及其表型，以及在部分二倍体中的显隐性关系。

表1-7　几种有代表性基因突变型及部分二倍体的基因产物的相对浓度

在大量实验研究和理论探讨的基础上，雅各布在20世纪60年代提出了“操纵子（operon）”概念。他说：“像LacOZYA这样在结构上紧密连锁，在信息传递中以一个转录单位起作用而协调表达的遗传结构是一个操纵子。”这个新概念后来由他和莫诺共同发展为阐述基因表达遗传调控的操纵子学说。这个学说认为，由操纵基因和受它调控的结构基因簇紧密连锁协调表达而形成结构和功能统一的操纵子，整个操纵子受调节基因的调节，调节基因的产物是阻遏物。在没有诱导物的条件下，阻遏物和操纵基因结合，抑制结构基因簇的表达；当出现诱导物时，阻遏物转而和诱导物结合而释出操纵基因，这时RNA多聚酶得以通过与操纵基因区段的结合而导致结构基因的转录和翻译，使结构基因簇的功能以一个完整的转录单位（transcription unit）得以表达。图1-28以Lac操纵子为例说明了操纵子学说的主要内容。

概括起来，雅各布和莫诺的理论提出了一系列新的概念，如结构基因、调节基因、操纵基因、操纵子和阻遏物、诱导物等。结构基因编码蛋白质一级结构；调节基因编码阻遏物；阻遏物能通过和操纵基因的结合，而控制结构基因的信息从DNA向蛋白质的传递速率；操纵基因和受它控制的功能相关的结构基因簇组成操纵子。结构基因服从“一个基因一种蛋白质”的原则，而调节基因和操纵基因可调节和影响多种蛋白质的合成。

雅各布和莫诺在他们的经典论文的最后写道：“为什么细胞中的基因不在所有的时间表现其全部遗传潜能呢？这是因为生物体的生存需要协调，协调就要求抑制。恶性肿瘤也许是抑制遭到破坏后危及生命的一个实例。”

图1-28　大肠杆菌乳糖操纵子（Lac operon）调控模型

在分子水平上证实操纵子学说的最富戏剧性的一幕，是操纵基因的分离及其核苷酸序列的测定。吉尔伯特和米勒希尔利用他们分离到的LacI编码的阻遏物为工具，分离了大肠杆菌的Lac操纵子的操纵基因。他们先把含有Lac片段的噬菌体DNA提取出来，用超声波将该DNA切分成长度为1 kb左右的片段。然后加入阻遏物使之和DNA片段混合液中的包含LacO的片段结合。孵育一定时间后，用硝酸纤维滤膜过滤，这时游离的DNA片段会透过滤膜，结合了阻遏蛋白的DNA片段则会滞留在滤膜上。收集DNA和阻遏物结合所形成的复合物，加入过量的IPTG，使IPTG与阻遏物结合，而释出包含了LacO的DNA片段。富集DNA后重新溶解，再加入阻遏物，以保护LacO区段。然后用胰源DNA酶处理，除去未与阻遏物结合的两侧DNA（图1-29）。收集LacO-阻遏物复合物，再用IPTG脱去阻遏物，得到LacO DNA。最后以此为模板，转录出RNA并测定其核苷酸序列。结果表明，LacO包括28对碱基，碱基组合呈轴对称。操纵基因的这种对称性和阻遏物的四聚体结构是相互匹配的。

图1-29　 LacO的分离程序及其核苷酸序列（改自W.Gilbert等）

在结束本章的时候，我们简单回顾一下基因概念产生和发展的历史。

孟德尔的工作表明，基因是在生物遗传性状的传递和表达上具有相对独立性的遗传物质单位。斯特蒂文特关于复等位基因的工作、伊斯特关于数量性状的工作、马勒关于果蝇诱变的研究，都极大地延伸了孟德尔的基因观，但没有从根本上改变它。

在萨顿假设的启示下，摩尔根把基因定位于染色体上，证明基因是在染色体上作直线排列的遗传物质单位，它是突变、重组和功能表达三位一体的。摩尔根学派的工作把遗传学发展到了一个全新的阶段，解决了基因的物质载体问题。

比德尔和埃弗吕西、塔特姆的合作取得了突破性的成就，用实验证明基因是决定蛋白质一级结构的遗传物质单位。他们从研究基因的原始作用出发，促进了遗传学向分子水平发展。

以卢里亚和德尔布吕克为代表的噬菌体学派，率先利用结构最简单的生命体噬菌体来研究蛋白质和核酸这两大类生命大分子在遗传和变异中的作用。

J.F.格里菲思的转化实验引出了艾弗里的判断性实验，他和同事用反证法证明基因的化学本质是DNA。沃森和克里克提出DNA双螺旋模型是分子遗传学的开端。梅塞尔森和斯塔尔的实验解决了DNA自体催化问题，中心法则和遗传密码表的确立使DNA异体催化功能具体化。在这个阶段，基因被看作是一段具有特定的遗传学功能的DNA片段。雅各布和莫诺的操纵子学说使基因概念又获得一次升华。人们看到基因是一个在特定的遗传调控系统的调节和控制下表达其功能的遗传物质单位。在操纵子学说提出后6年，吉尔伯特和米勒希尔分离到阻遏物和操纵基因，为建立在整体调控水平上的基因理论奠定了坚实的基础。

回顾过去，我们看到科学家们在具体的历史条件下提出的概念和学说会随着科学的发展和技术的进步而改变，或修正，或发展，或扬弃，或更新。然而，科学家们的创造性思维和独具匠心的实验研究对科学发展的贡献却是永恒的。我们以著名的分子遗传学家科恩在纪念莫诺时讲的一段话作为本章的结语：

“我认为莫诺是我们这个时代最富于创造性的人物之一。这并不是因为他曾经是正义事业的领袖，也并非由于他是分子生物学的一位创始人，或研究机构的奠基人和导师。他之所以成为最富创造性的人物，是因为他以无私无欲而又深沉执着的思考来探索获取知识的道路。他坚信唯有这种求知的过程才应该成为学术体系的伦理价值和美学价值的基础。”