茚三酮比色法测定氨基酸总量

一、实验目的

掌握茚三酮比色法测定氨基酸总量的方法和流程。

二、实验原理

凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸(脯氨酸除外)在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。

氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤:

三、实验材料、仪器与试剂

(1)材料:市售酱油。

(2)仪器:可见分光光度计、分析天平、容量瓶、移液管、具塞刻度试管、烧杯(50mL、100mL)。

(3)试剂:

①2%茚三酮溶液:称取1g水合茚三酮(C9H4O3·2H2O)溶于25mL热水中，加入40mg氯化亚锡(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滤液放在冷暗处过夜，用水定容为50mL，保存于冷暗处。

如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用。方法是:取5g茚三酮溶于20mL热水中，加入0．2g活性炭，轻轻摇动，放30min后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1mL冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。

②磷酸盐缓冲液(pH8．04):

(a)1/15mol/L磷酸二氢钾溶液:取KH2PO40．9070g溶于100mL水中。

(b)1/15mol/L磷酸氢二钠溶液:取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)23．876g溶于水，加水至1000mL。

取(a)溶液50mL与(b)溶液95mL混匀即得。

③10%醋酸:取10mL冰醋酸加水定容至100mL。

④氨基酸标准溶液(200mg/L):称取干燥的氨基酸(甘氨酸，或其他的氨基酸)0．2000g溶解于水，定容为1000mL。

四、实验步骤

(1)样品处理:量取0．5mL酱油于50mL烧杯中，加入5g活性炭和40mL的蒸馏水，在电炉上加热至80℃左右，保持半小时后过滤至100mL容量瓶中，用蒸馏水将滤渣清洗数遍后转移容量瓶中，定容至刻度线备用。

(2)标准曲线的绘制及样品测定。

按表4－3进行加样，各种试剂加到比色管后混匀，于水浴锅上沸水浴15min，取出冷却至室温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光值，以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

表4－3　甘氨酸标准曲线及样品与茚三酮反应实验设计表(单位:mL)

同时，在相同条件下测定样品吸光值，用测得的该吸光值在标准曲线上即可查得对应的氨基酸微克数。

五、结果计算

式中:C——从标准曲线上查的氨基酸的μg数;

M——测定的样品溶液相当于样品的质量(g)。

六、注意事项

(1)通常样品处理方法为:准确称取粉碎样品5～10g或吸取液体样品5～10mL，置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀备用。

(2)脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。

(3)有颜色的样品必需经脱色处理至无色后方可使用。

七、思考题

茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定?