染料结合比色法

四、染料结合比色法

（一）实验目的

1．了解考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的基本原理。

2．掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的基本实验方法。

（二）实验原理

当考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，呈深蓝色，最大吸收峰从465nm转至595nm。在一定蛋白质浓度范围内，595nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比，据此可定量测定蛋白质浓度。

本方法灵敏度高，可测定1～10μg含量的蛋白质。

（三）实验药品、实验设备

1．血清：人血清，用蒸馏水稀释200倍；

2．考马斯亮蓝G-250（CBG）试剂：称取l00mg考马斯亮蓝G-250，溶于50m195％乙醇中，并加入85％磷酸l00mL，再加蒸馏水至1000mL；

3．1g/L蛋白质标准液：准确称取牛血清蛋白1mg，溶解在l mL蒸馏水中；

4．0.9％NaCl溶液；

5．分光光度计；

6．15mm×150mm试管；

7．刻度吸管；

8．试管架；

9．1000mL量筒。

（四）实验方法

1．标准曲线制作

取6支大试管编号，按表2-15所示顺序和剂量加入各试剂。

表2-15　染料结合比色法工作曲线

混匀，室温静置3min，用分光光度计在595nm波长下，以“0”管试液作参比液，读取各管吸光度。

以各吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓度为横坐标，绘制吸光度-蛋白质浓度标准曲线。

2．血清测定

取两支大试管编号，按表2-16所示顺序和剂量加入各试剂，摇匀，室温静置3min，用分光光度计在595nm波长下，以空白管试液作参比液，读取测定管吸光度。

表2-16　血清中蛋白质浓度的染料结合比色法测定

3．结果处理

根据测定管的吸光度从标准曲线上查得相应的蛋白质浓度，再乘以稀释倍数即为血清中蛋白质的浓度。

4．注意事项

（1）干扰本法的因素很少，且染料与蛋白质结合反应快，显色稳定，可保持1h，重复性好。

（2）本法受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质的染色强度差异不大。

（3）样品需要量少，一般只需50～100μL，且灵敏度极高。

（五）实验记录

1．标准曲线的绘制。

2．实验记录：

（六）思考题

1．试比较本法和其他蛋白质定量方法的优缺点。

2．本法操作的关键是什么？

【注释】

[1]*冰醋酸一般都含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸。