受体的放射配基结合分析

【原理】　用放射性核素标记配基与相应的受体进行特异结合，测定复合物的放射性活度，从而对受体进行定性和定量，该分析方法称为受体的放射配基结合分析（radioligand　binding　assay，RBA）。

受体和配基的结合反应服从可逆反应的质量作用定律，可用下式表示：

式中［R］和［L］为游离受体和游离配基的浓度，［RL］为复合物浓度，k1和k2为结合速率常数（association　rate　constant）和解离速率常数（dissociation　rate constant）。

结合反应达到平衡时，对一定量的受体［RT］来说，［RL］的量取决于所加标记配基的量［LT］和配基与受体的亲和力（用平衡解离常数equilibrium　dissociation constant，即KD来表示，KD＝k2／k1＝［R］［L］／［RL］）。

1．饱和曲线　当标记配基浓度［LT］较低时，只有部分［RT］形成［RL］，［LT］越大形成的［RL］越多。但是由于［RT］数量有限，所以［RL］不是直线上升，而是上升先快后慢的曲线，当［LT］超过［RT］很多时，［RL］的上升就非常缓慢，接近［RT］了，这就是饱和曲线。曲线的高度取决于受体的总数［RT］。在曲线起始段，相同量的［LT］形成的［RL］量取决于配基与受体的亲和力，所以，KD越小（亲和力越大），饱和曲线上升越快。

2．竞争性取代反应（competitive　displacement　reaction）　若受体和放射配基的结合反应系统中另加入该受体的非标记配基，则后者会与放射配基竞争受体。非标记的配基可以是激动剂（agonist），也可以是拮抗剂（antagonist）。

如果在竞争反应中固定放射配基量［LT］，改变竞争剂的量［IT］，则随［IT］增加而复合物放射性［RL］逐步减少，这就是“竞争抑制曲线”。如果用竞争剂浓度的对数作横坐标，复合物的放射性作纵坐标，则对单位点系统（系统中能与放射性配基结合的受体是单一的，亲和力都一样）来说，竞争抑制曲线是对称的反S形曲线。竞争剂的亲和力越高，曲线在坐标图上的位置越靠左。这种方法对比较不同配基与同一种受体的亲和力非常有用。

当系统中的受体有两种或更多种的结合位点能以不同的亲和力和配基结合，或者结合过程中有正协同或负协同，则饱和曲线和竞争抑制曲线的形状都比较复杂，主要用于研究工作，临床上应用较少。本文仅讨论简单（无正、负协同）单结合位点的系统。

【基本条件】

1．受体标本的制备

（1）分离亚细胞组分：多数RBA须经差速离心法分出胞膜、胞浆、胞核等所需的组分进行分析。其优点是：①除去大部分杂蛋白和内源性配基，减少NSB或其他干扰因素。②受体蛋白浓缩，可获得较可靠的分析结果。组织块或细胞悬液先在含0．25～0．3mol／L蔗糖的缓冲液中制成匀浆，先低速后高速进行离心，分离不同的亚细胞组分。为保证受体的结合活性，整个制膜过程必须在4℃以下操作；缓冲液（Tris－HCl或磷酸盐系统等）应有适宜的离子强度、pH值（7．4～7．8），有的受体需加EDTA、Mg2＋、蛋白酶抑制剂等。据作者的经验，小块组织－70℃可保存3个月之久，膜制剂在－70℃的保存比组织块更好。

（2）完整活细胞：血细胞、肝或脾细胞、肿瘤的腹水型细胞、传代或原代培养细胞等的悬液可用完整活细胞进行RBA反应。主要优点是：①可同时观察受体结合特性和细胞的其他生物效应；②受体处于接近正常的环境中，得到的结果更能反映受体的生理特性；③能直接给出平均每一细胞的受体分子数。

（3）组织切片：为保持组织切片中受体的活性，通常用冰冻切片，标本厚度5～50μm，粘贴于涂有明胶的玻片上，滴加含放射配基的缓冲液进行结合反应。然后洗去多余的游离配基，刮下组织切片测放射性活度，也可用放射自显影或免疫组化研究受体的分布。

2．标记配基的选择　受体的RBA不用标准品，只能通过放射配基的用量和比活度，以及测定结合部分的放射性活度，计算出受体的有关参数。因此对所用的标记配基有很严格的要求。

（1）高比活度：RBA标本中受体数量一般都很少，为0．001～1pmol／mg蛋白，要得到满意的结果就必须用高比活度配基。通常要求3．7×1011　Bq（10Ci）／mmol以上。

（2）高亲和力：亲和力高的标记配基在浓度较低时便可达到饱和，因此用量可节省。此外，形成的复合物解离常较慢，有利于结合和游离配基的分离。

（3）高特异性：首先是与其他种类的受体交叉反应要尽量少，否则须预先除去标本中有交叉反应的受体。对于有两种以上亚型的标本，还须注意配基对亚型的选择性。

（4）高放射化学纯度：RBA中受体参数的计算以标记配基的用量和比活度为依据，较多的放射性杂质有时可导致计算错误。一般要求放化纯度在95%以上。

3．非标记配基的选择　非标记配基有两个用处。一是测定NSB，二是在竞争结合反应中作竞争剂，此处主要说明如何测定NSB。测NSB的做法是：在测定总结合TB时，同时设置一系列平行管，除相同量的标记配基及受体标本外，另加入非标记配基，后者可以是标记配基的同种或异种化合物，但必须与该种受体有高亲和力。非标记配基的用量应使99%以上的受体不再与标记配基结合，如此测得的结合部分放射性代表非特异结合NSB。NSB通常由结合属大容量低亲和力，往往随［LT］的增加而直线上升，如果实验中测定不同［LT］的［RL］（如在多点饱和曲线系统中），仅须作3～4点，通过直线回归即可求出任何［LT］的NSB。

4．结合反应的类型

（1）多点饱和曲线：每一受体标本做6～8个实验点（双位点需更多些），逐点增加标记配基的量，低剂量应覆盖不饱和区，高剂量应覆盖饱和区，以便得到较典型的饱和曲线。此法能给出较多参数，如RT、KD、反映实验误差大小的平均残差等，可信度也较高，但工作量较大。

（2）单点法：通常在多点饱和曲线上选一个使受体基本饱和的标记配基量，根据结合部分的放射活度算出受体结合位点的克分子数。该方法操作简便，所需标本量少，适于临床检验和药物筛选，但只能给出受体密度，略小于饱和曲线法。

5．反应的环境条件　结合反应的平衡常数随反应系统pH、缓冲液及温度等的不同而变化。故这些因素均需实验严格选择并加以固定，以保证分析的重现性。

（1）pH、缓冲液：结合反应的pH应处于生理范围（pH　7～8）。常用缓冲液为Tris－HCl和磷酸盐系统等，完整细胞反应系统可用Hanks液等细胞培养液。缓冲液离子强度有一定要求，一般是10～50mmol／L。标记和非标记化合物、受体标本均以该缓冲液稀释配制。

（2）温育温度和时间：温度是影响反应速率的重要因素。温度在0～37℃间变化，结合和解离速率逐步变大。温度低有利于复合物的稳定，但不利于原有内源性配基的解离。每一具体反应系统的温度和温育时间须经预试验确定，通常都要求达到反应平衡。

（3）反应体积：复合物的形成量和各试剂的浓度呈正相关，因此各管的反应体积要固定，体积应适当小，通常选200～500μl。

6．结合与游离部分的分离　分离的目的是将反应平衡后形成的标记配基和受体的复合物与游离标记配基分开，然后才能测定复合物的放射性活度。一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在分离过程中要使复合物的解离降低到最低程度。低温和快速是最有效的措施。常用的分离方法有过滤、离心、吸附、透析、电泳等，凡RIA中用的分离方法基本都可以采用。

对完整细胞、胞膜、胞核受体样本的分离，目前最常用的分离方法是过滤法。过滤材料主要是玻璃纤维滤膜，此法操作简便、分离效果较满意。但是对有些游离的标记配基有明显的非特异吸附，使NSB升高，需要采取一定措施，例如预先用牛血清白蛋白浸泡等。对胞浆受体样本的分离，往往采用葡聚糖涂膜活性碳法（DCC）或凝胶过滤法等。

【测定方法】

1．单点法求受体量　先通过多点饱和曲线法取标记配基饱和区的单一浓度，与一定量的膜蛋白制剂进行结合反应，Lowry法定蛋白，根据复合物的放射性活度计算受体密度。该法特点是可减少受体膜标本的用量和减少工作量，适用于临床和药物的筛选但不能求亲和力。

（1）试剂：以膜受体为例。选定的标记配基、测定NSB的非标记配基、待测标本均用选定的缓冲液稀释，并经预试验选定各自的浓度。

（2）加样步骤：全部做3复管，各总结管和NSB管全部加相同浓度的标记配基和相同量的膜蛋白，平行的NSB管另加一定量的非标记配基，用缓冲液补足到一定体积。

（3）温育和分离：反应管在一定温度振摇温育一定时间（通过预实验选定），立即通过多头细胞收集器用冰冷缓冲液终止反应，迅速抽滤至两层玻璃纤维膜上，并以10ml冰水淋洗。滤膜80℃、30min烘干，投入闪烁液内作固相测量。另取一定体积标本测定蛋白含量。

（4）数据处理：先将复合物放射性测量得到的cpm换算成受体数量即fmol数，再被标本中的蛋白量除，换算成受体密度（fmol／mg蛋白）。因为多数复合物中受体和配基是1∶1的关系，所以单位换算的公式是：

如果受体和配基以1∶2的关系形成复合物，则上式还应被2除。注意上式中分子是标本的特异结合，所以须事前从总结合TB减去非特异结合NSB。配基比活度应换算成dpm／fmol。标本的蛋白量须用生化方法测定。Bradford法只适用于可溶性蛋白，结合在膜或核上的蛋白以Lowry法较可靠。完整细胞也可不定蛋白而对细胞进行计数，得到fmol／106细胞，或受体分子数／106细胞（1fmol＝6．04 ×108个分子）。

2．多点饱和曲线法求受体的量和亲和力

（1）试剂：以膜受体为例。选定的标记配基、测定NSB的非标记配基、待测标本的膜蛋白均用选定的缓冲液稀释，并经预试验选定各自的浓度范围。

（2）加样步骤：全部做双复管，各总结合TB管［（6～8）管×2］加浓度逐步递增的标记配基，平行的NSB管（3或4管×2）另加非标记配基，最后加一定量膜蛋白，反应总体积全部用缓冲液补足至一定量。

（3）温育和分离：各反应管在一定温度振摇温育一定时间（通过预实验选定），立即通过多头细胞收集器用冰冷缓冲液终止反应，迅速抽滤至两层玻璃纤维膜上，并以10ml冰水淋洗。滤膜80℃、30min烘干，投入闪烁液内作固相测量。另取一定体积测定蛋白含量。

（4）数据处理

①Scatchard作图法：根据质量作用定律，当反应达到平衡时，k1［R］［L］＝k2［RL］，因为［R］＝［RT－RL］，k2／k1＝KD，所以从式1可得到Scatchard函数：

可以看出，若以［RL］为自变量（横坐标），［RL］／［L］为因变量（纵坐标），应是一直线，其斜率是－1／KD，横截距就是［RT］。所以可先将各实验点的实测值减去相应的NSB，再换算成fmol，然后进行直线回归（简单的计算器便可完成），得到［RT］和KD。Scatchard作图法因为坐标换算，低剂量区误差被放大，所以用来求［RT］及KD并不是很好的办法，目前它的用处主要是发现正、负协同以及不属于简单单位点的情况。其他直线化方法，如Lineweaver－Burk函数、Woolf函数等，也有类似缺点。

②计算机直接曲线拟合：上述式（3）展开、重排，就得到饱和曲线的直接表达式：［RL］2（［RL］［RT＋LT＋KD］＋［RT］［LT］＝0（4）

该式是二次方程，直接代表饱和曲线，不能用人工或简单的计算器拟合，但是用计算机拟合很方便。可以用一般的最小二乘法，也可用稳健回归法。［RT］和KD是待求参数，［LT］是自变量（横坐标），［RL］是因变量（纵坐标）。拟合时先减去相应的NSB，将cpm换算成fmol，然后将各实验点的［LT］和［RL］代入式4，拟合求出［RT］和KD。

3．单位点竞争法　一定浓度的受体标本和一定浓度饱和区标记配基起结合反应，同时在该反应系统中加不同浓度的非标记竞争剂（激动剂或拮抗剂），最后测定复合物的放射性活度，得到一条竞争曲线。用数学模型求出竞争剂的平衡解离常数（KI）和使结合减少一半所需的竞争剂浓度（IC50）。主要用于临床和新药筛选。

（1）试剂：以存在于细胞浆中的核受体为例，选一定量的标记配基、一定量的浆受体标本（［LT］＞＞［RT］）、及一定范围的作竞争剂用的非标记配基（要求覆盖4～5个数量级），此外还应选另一种非标记配基（一个浓度）供测定NSB用。全部试剂用选定的缓冲液配制。

（2）操作步骤：全部做双复管，各试管中加入相同量的标记配基、浓度逐步递增的非标记竞争剂（第一对复管不加非标记竞争剂，最后一对复管加测定NSB的非标记配基）、以及相同量的浆受体标本，全部用缓冲液补足体积至一定量。

（3）温育和分离：各反应管在一定温度振摇温育一定时间（温度和时间通过预实验选定）后，立即浸入冰水浴，每管加0．5%DCC（葡聚糖包膜活性炭）0．6ml，混匀放置15min，4℃快速离心1　000r／min，5min，吸取上清液0．7ml，加至3ml乳化法闪烁液，摇匀后用液体闪烁计数器测放射性。另取一定体积标本测定蛋白含量。可以得到一条竞争抑制曲线。

（4）数据处理：

①目测法：先将各实验点的TB减去NSB，连成反S形曲线，在坐标纸上取复合物放射性被抑制50%时的竞争剂浓度，即IC50。再按下式转换成竞争剂的平衡解离常数KI。下式的使用，有一先决条件，即［LT］＞＞［RT］，否则算得的KI将有较大偏差。

IC50和KI是非标记竞争剂的参数，［LT］和KD则是放射配基的参数。IC50随［LT］的大小而变化，KI则是某一化合物的特征常数，只随受体的品种而变化。但是要计算KI必须先用饱和曲线法求出KD。

②简单单位点竞争抑制数据处理的计算机程序：因为系统中增加了非标记配基，形成两个反应，所以式4变为式6。

该式中KI和［I］分别是竞争剂的平衡解离常数和游离竞争剂浓度，［I］由加入的竞争剂浓度［IT］近似。实验中［LT］是固定量，KD须预先用饱和曲线法求出确定的数值代入，于是［I］是自变量，［RL］是因变量。［RT］和KI是待测参数，由最小二乘法或稳健回归法拟合后求出，也可再由式5求出IC50。