染料结合法

在酸性环境下,蛋白质分子可解离出带正电荷的NH 3+,它可与染料的阴离子产生颜色反应。常用的染料有氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等。前两种常作为血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂糖凝胶电泳的染料。考马斯亮蓝常用于需更高呈色灵敏度的蛋白电泳,也用于测定尿液、脑脊液等蛋白质,优点是简便、快速、灵敏,缺点是不同蛋白质与染料的结合力不一致,且试剂对比色杯有吸附作用。

(一)血浆(清)清蛋白测定

清蛋白结合的染料有多种,其中溴甲酚绿(bromcresol green,BCG)和溴甲酚紫(bromcresol purple,BCP)最常用。BCP法受球蛋白和其他血浆蛋白的干扰较小,但与BCG法相比,灵敏度较低。此外BCP与非人源性清蛋白结合力相当弱,不适合用于动物标本中清蛋白含量测定,而质控血清多用动物血清制备,故BCP的应用受到一定限制。

【原理】 清蛋白在p H4.2的缓冲液中带正电荷,在有非离子型表面活性剂存在时,可与带负电荷的染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色复合物,在波长628nm处有吸收峰,其颜色深浅与清蛋白浓度成正比,与同样处理的清蛋白标准液比较,可求得血清清蛋白含量。

【试剂与器材】 可购商品试剂或自配。

1.BCG试剂 向约950ml蒸馏水中加入0.105g BCG(或0.108g BCG钠盐),8.85g琥珀酸,0.1g叠氮钠,4ml浓度为300g/L聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)。完全溶解后,用6mol/L NaOH溶液调节至p H4.15~4.25。用蒸馏水加至1L。试剂配成后,分光光度计628nm,蒸馏水调零测BCG试剂的吸光度,应在0.150A左右。贮存于聚乙烯塑料瓶内,密塞室温保存,至少可稳定6个月。

2.BCG空白试剂 除不加入BCG外,其余成分和配制程序与BCG试剂配制相同。

3.60g/L清蛋白标准液 称取人血清清蛋白6g、叠氮钠50mg,溶于蒸馏水中并缓慢搅拌助溶,配成100ml。密封贮存于4℃冰箱,可稳定半年。也可用定值参考血清作清蛋白标准液。

4.仪器 自动生化分析仪或分光光度计。

【操作】

1.自动生化分析仪分析法 参数设置参照有关仪器和试剂盒说明书。

2.手工操作法 按表6-4操作。

表6-4　BCG法测定血清清蛋白操作步骤

在628nm处用空白管调零,逐管加入BCG试剂,并立即混匀。每份血清标本或标准液与BCG试剂混合后,均需在30s±3s内,读取吸光度。

如遇脂血浑浊标本,可做标本空白管:取血清0.02ml,加入BCG空白试剂5.0ml,波长628nm,用BCG空白试剂调零,读取标本空白管吸光度。用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后的净吸光度,计算清蛋白浓度。

【计算】

【参考区间】 成年人:40~55g/L;4-14岁儿童:38~54g/L。

【临床意义】

1.血清清蛋白增高 常见于严重脱水所致的血浆浓缩,并非蛋白质绝对量增多,或输入过量的清蛋白。迄今尚未发现单纯清蛋白增高的疾病。

2.血清清蛋白降低 通常与总蛋白降低原因大致相同,但有时降低程度不一致。急性降低多见于急性大出血或严重烧伤时血浆大量丢失。慢性清蛋白降低多见于肝合成清蛋白功能障碍、肾病、恶性肿瘤等,严重时可≤10g/L。清蛋白<20g/L时,由于胶体渗透压严重下降,患者常表现为水肿。先天性清蛋白缺乏症并不出现水肿。

【质量保证】

1.BCG是一种p H指示剂,变色阈为p H3.8(显黄色)~5.4(显蓝绿色),因此控制反应液的p H是本法测定的关键。

2.配制BCG试剂也可用其他缓冲液,如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液。但以琥珀酸盐缓冲液的校正曲线通过原点,线性好,灵敏度高,成为首选推荐配方。

3.当60g/L的清蛋白标准液与BCG结合后,溶液光径1.0ml,在628nm处测定的吸光度应为0.811±0.035,如达不到此值,表示灵敏度较差。

4.BCG试剂除与清蛋白结合呈色外,与血清中其他多种蛋白质也有呈色反应,但反应在30s之内对清蛋白特异,30s后非特异性增高。因此BCG测定时应严格控制反应时间。

(二)血清球蛋白测定

由于球蛋白基本不结合外源性染料,目前血清球蛋白的测定实际上是一个计算值,即:球蛋白(g/L)=总蛋白(g/L)-清蛋白(g/L)。

同时,计算清蛋白与球蛋白的比值(A/G),A/G=清蛋白(g/L)/球蛋白(g/L)

【参考区间】 成年人20~40g/L;A/G=(1.2~2.5)∶1。

【临床意义】 球蛋白增高:多见于自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、硬皮病、风湿热、类风湿关节炎等,炎症或急慢性感染,如结核病、麻风病、疟疾、黑热病、血吸虫病、病毒性肝炎,还见于恶性M蛋白血症,如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、巨球蛋白血症等。