有机改良水稻土中胡敏酸组分及其特性

有机改良水稻土中胡敏酸组分及其特性

Prabhat Pramanik1　Pil Joo Kim1　著　文　静2　林启美2　译

(1　庆尚大学应用生命科学部　晋州　南韩　660-701　2　中国农业大学资源与环境学院　北京　100193)

摘　要：胡敏酸普遍存在于陆地环境中，是一种含有多个芳香族和脂肪族复杂结构的混合物。本研究基于胡敏酸的极性(腐殖化程度)对其进行分组，其中200P，300P和400P组分的腐殖化程度相对高于800P和800S。施用有机改良剂显著提高了水稻土胡敏酸组分的浓度，尤其是腐殖化程度较高的那些组分。不同组分中，300P的含量最高，施用堆肥显著提高300P含量。甲基酮和桂醛等化合物是300P的主要成分，约占90%。

关键词：胡敏酸分组　腐殖化程度　傅里叶变换红外光谱仪　裂解气质联机色谱仪　水稻土

Fractionation and Characterization of Humic Acids from Organic Amended Rice Paddy Soils

Prabhat Pramanik1, Pil Joo Kim1 write Wen Jing2, Lin Qimei2 translate

(1 Division of Applied Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, South Korea, 660-701　2 College of resources and environment, China Agricultural University, Beijing, 100193)

Abstract: Humic acids (HAs), mixture of several complex-structured aromatic and aliphatic compounds, are ubiquitous in the terrestrial environment.In this study, HAs were fractionated on the basis of their polarity (degree of humification).The fractions namely 200P, 300P and 400P were comparatively more humified than fractions like 800P and 800S.The application of organic amendments significantly increased concentrations of HA fractions especially the more humified fractions in rice paddy soils.Among the different fractions, 300P fraction was the most abundant in rice paddy soils and its concentration was significantly increased due to compost application.The compounds like methyl ketone and 3-phenylprop-2-enal contributed almost 90% of 300P fraction.

Key words: fractionation of HA; degree of humification; FTIR; Pyrolytic GC–MS; rice paddy soil

全球土壤碳库分别是大气碳库和生物碳库的3.3倍和4.5倍。土壤有机质(SOM)是农业生态系统基本组成要素，在土壤物理、化学和生物学等多种特性中起着重要的桥梁作用。有机碳约占全球土壤碳库的62%，其中至少50%为化学稳定形态的腐殖物质。可提取腐殖质在自然界中普遍存在，并在可持续农业中起着重要的作用。一般来说，腐殖质为无结晶、褐色至黑色、酸性的多分散性物质，分子量在几百至几千之间。根据其溶解性，腐殖质可分为胡敏酸(HAs)和富里酸(FAs)。胡敏酸是土壤有机质最稳定的组分，是有机残体经过微生物分解的产物。一些研究者利用精密仪器，如傅里叶变换红外光谱(FTIR)和核磁共振(NMR)，研究胡敏酸的化学特性。研究发现，胡敏酸由富含多种官能团的有机物质组成，包括芳香族、脂肪族、酚类和对苯二酚类化合物，这些物质含量和比例因腐殖化程度而异。根据分子大小，也可将胡敏酸分为高分子量和低分子量两大类。Zavarzina等(2008)根据胡敏酸的疏水性、大小及其依赖于电荷运动性的差异，对胡敏酸进行分类。Zech等(1997)报道，作物残茬的腐殖化作用，常常提高羧基碳、烃基碳和芳香族碳(主要是酚类官能团)含量，而减少O-烷基碳含量。一般说来，腐殖化程度较高的有机物，更容易与土壤胶体上的电荷位点结合，从而形成良好的团粒结构，改善土壤物理、化学和生物学性质，提高土壤肥力。然而，人们在分析胡敏酸组分特征之前，并没有根据其腐殖化程度的差异对其进行分组。本研究假设，由于初始底物及分解过程存在差异，胡敏酸的腐殖化程度可能有所不同。本研究的目的在于：根据胡敏酸腐殖化程度的差异，建立一种胡敏酸分组的新方法，并用施用有机改良剂的水稻土作为参比，测定各组分的相对浓度。

1　材料与方法

1.1　胡敏酸提取

本研究利用以前试验所采取的水稻土样品，对提取方法进行标准化检验。该土壤为火山灰土，有机碳含量为10.64±0.95 mg/g，胡敏酸含量为0.26±0.09 mg/g。采用Kuwatsuka等(1992)改进方法提取胡敏酸，即在氮气条件下，一定量土壤样品在NaOH(0.1 mol/L)•NaCl (30 g/L)溶液中振荡过夜，离心后收集上清液。沉降物用NaOH•NaCl清洗两次，洗涤液与上清液合并用于胡敏酸分组测定。用6 N HCl溶液调节pH至1.5-2.0，沉淀即为胡敏酸，上清液则为富里酸(FAs)。胡敏酸在HCl-HF溶液中震荡(1:1, 体积比)，以去除无机物，再溶解于NaOH•NaCl溶液中用于分组。

1.2　胡敏酸分组

根据极性的差异对胡敏酸进行分组，基本原理是：通过改变溶液的极性来改变介电点，从而使不同的组分分离出来。将150 mg的胡敏酸沉淀物溶于12 mL溶剂中，加入3 mL无水酒精，充分混合，使乙醇浓度为200 mL/L。4 ℃下静置过夜，离心，沉降物即为200 P组分。冲洗沉降物，将冲洗液和离心的上清液混合，并加入一定量的乙醇，使乙醇浓度为300 mL/L，4 ℃下过夜后离心，沉降物即为300 P组分。重复上述步骤，调节乙醇浓度为400 mL/L和800 mL/L，可分别获得400 P和800 P组分(图1)，而溶于800 mL/L乙醇溶液的胡敏酸为800 S组分。所有组分测定质量后，再溶于NaOH•NaCl溶液中，浓度调节为2.33 mg/ mL，做进一步分析。

1.3　胡敏酸组分的化学特征

用重铬酸钾氧化法测定各组分有机碳含量，Varian紫外分光光度计(model: Cary 50 Conc)测定在400 nm和600 nm下的吸光度。将1 mg胡敏酸粉末与50 mg光谱级溴化钾混合制成小球，用分辨率为4 cm-1的Perkin-Elmer 1725x FTIR光谱仪测定红外光谱(图1)。

图1　本研究所收集的胡敏酸各组分(浓度为2.33 mg/mL)

Fig.1 Humic acid fractions (concentration: 2.33 mg/mL)collected during this study

1.4　水稻土胡敏酸分析

1.4.1　水稻田间试验

试验在韩国庆尚大学的一个农场进行，分别施用风干和发酵的牛粪。供试土壤为Andiaquands，粘壤质，排水较差。试验开始前，有机碳和酸碱度分别是11.79±1.51 mg/g和pH 6.32±0.43(水土比为1:5)。试验设3个处理：对照、风干牛粪(简称为牛粪)和发酵牛粪(简称为堆肥)，牛粪和堆肥的用量均为2 t/ha，小区面积100 m2(10 m×10 m)，3次重复，随机排列。牛粪和堆肥的总有机碳含量分别是43.8±4.2 mg/g和29.4±3.8 mg/g，胡敏酸含量分别是0.85±0.09 mg/g和1.73±0.07 mg/g。所有处理(包括对照)采用推荐化肥施入量，即尿素90 kg/ha，过磷酸钙45 kg/ha，氯化钾58 kg/ha。供试水稻为Dongjinbyeo(日本)，30天的秧苗移栽在淹水稻田，整个试验期间稻田水面维持在5～7 cm。

1.4.2　胡敏酸分组及其化学特征

在水稻收获期采集土壤，研究施用有机改良剂对胡敏酸各组分相对浓度的影响。采用上述方法提取和分离胡敏酸各组分。Finnigan GC-8000 TOP-Voyager气质联机分析仪(GC-MS)与CDS-1500热裂解炉结合，分析胡敏酸各组分的化学特征。取约2.0 mg的胡敏酸样品与过量的N，O-双 (三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)混合进行硅烷化作用，并加入三甲基氯硅烷(TMCS)作为催化剂(BSTFA:TMCS=5:1, v/v)。将反应产物注入到CDS-2000热解探头中，以10 ℃/min的速度从70 ℃升至610 ℃后，保持10 s。以氦气作为载气将热解产物带入熔硅柱中(30 m×0.32 mm×0.25 μm，J&W)，熔硅柱表面覆盖有DB-5 ms。柱温起初控制在50 ℃保持3 min，然后以7.5 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃，最后在300℃保持2 min。离子源在70 eV和40-500 m/Z质量检测范围内运行(图2)。

图2　胡敏酸各组分的有机碳含量和吸光度

Fig.2 Organic C contents and spectrophotometric analysis data of HA fractions注：竖线为标准误差。下同。

1.5　数据分析

所有数据为3次重复的平均值，用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析。

2　结果

2.1　胡敏酸组分及其化学特征

采用标准方法，根据在不同极性溶液中的沉淀反应，从供试土壤分离得到200 P-800 P 7个组分，可溶性组分(800 S)作为第8个组分，各组分溶解在溶剂中，浓度均为2.33 mg/mL，根据颜色可以辨别出这些组分的差异(图1)。从200 P到800 S，总有机碳含量和A 600/C比值逐渐降低，总有机碳含量47%～63%，300 P最高为63%(图2)。A600/ C比值的变化趋势与总有机碳含量相同，虽然400 P的比值最高，但与200 P，300 P并没有显著性差异，相比而言，700 P，800 P和800 S的A600/C比值显著降低(P≤0.05)。

红外光谱数据显示，不同胡敏酸组分含有的官能团存在差异。加入乙醇越少(即极性越小)，酚类、杂环、羧酸、酮和不饱和化合物沉淀析出越多，浓度相对较高，尤其是300 P组分，这些化合物的浓度最高(表1)，而饱和碳化合物、醚和脂肪族-OH官能团在800 P和800 S组分中更加丰富。

2.2　水稻土中总胡敏酸及各组分的含量

不同处理水稻土胡敏酸浓度存在显著差异(P≤0.05)(图3a)，与对照相比，牛粪和堆肥显著提高了胡敏酸浓度，从对照的0.13±0.02 mg/g分别提高至0.27±0.03 mg/g和0.33±0.03 mg/ g。胡敏酸各组分的浓度受有机物添加模式的影响。不考虑有机改良剂的性质，300 P组分的浓度最高，占总胡敏酸34%～47%(图3b)，有机改良剂主要是增加了300 P组分的相对浓度。不同处理中，堆肥处理300 P浓度最高(相对比例为47%)，显著高于牛粪处理(相对比例为35%)。400 P(9%～26%)和600 P(7%～11%)的相对浓度高于余下组分(<8%)，显然余下组分含量很低，而且之间的差异也很小。

表1　胡敏酸不同官能团红外光谱峰积分面积

图3　不同处理水稻土的胡敏酸各组分含量的差异

Fig.3 Changes in HA fractions in rice paddy soils as affected by different treatments

2.3　300P组分的化学特征

裂解气质联机分析结果显示，300 P组分主要裂解产物包括吡啶、甲基酮、乙胺、2-硫代-3-甲基戊酮、3-羟基-2-烯、氮杂苯嗪、连氮或苄氧基胺，其浓度差异很大(表2)。其中，甲基酮(41.43%)和3-羟基-2-烯(48.20%)约占90%。

表2　热解气质联机检测的300P组分中的化合物

3　讨论

腐殖质是地球表面分布最广泛且最稳定的有机物质之一，胡敏酸由多种含碳的大分子化合物构成，是有机残体在异养微生物作用下，经过生物化学改变的产物。胡敏酸分组对于理解其与各种有机和无机化合物之间的相互作用，以及了解胡敏酸在自然环境和农田生态系统中的作用等，具有十分重要的意义。胡敏酸在环境中普遍存在，且具有多电解质特性，是一种重要的胶体和吸附剂，直接影响到土壤养分的有效性和一些生化过程。分子量大小是影响胡敏酸组分活性的重要因素之一，但稳定性和复杂的结构限制了对胡敏酸组分的分离及其特性分析。最近，人们用一些成熟的技术研究胡敏酸特性，如超滤、高效排阻色谱法(HPSEC)、针铁矿顺序吸附技术、酸沉淀核磁共振波谱分析技术等。本研究根据极性的变化，也就是基于腐殖化程度，将胡敏酸分为8个组分，即200 P-800 P和800 S，显然，腐殖化导致含碳有机物质缩合，腐殖物质含碳量提高，因此将总有机C含量和A600/C比值用作腐殖化程度的指标。本研究用A600/C比值评估胡敏酸各组分的腐殖化程度，此处A600和C分别为0.1 M溶液600 nm下的吸光度和碳含量。结果表明，根据极性和腐殖化程度的差异，土壤腐殖物质可分为多个组分，200 P，300 P和400 P组分有机碳含量和A600/ C比值较高，表明这些成分有机碳化合物缩合程度及腐殖化程度较高。显然，腐殖化程度较高的化合物，由于在极性溶液中变化较少，更容易沉淀下来。Watanabe等(2010)也观察到加入少量丙酮，导致更多的腐殖物质发生沉淀。

腐殖化过程中，有机质常发生生物化学氧化作用。堆肥是一项成熟的技术，通过腐殖化作用将有机废弃物转化为营养丰富的土壤改良剂。堆肥中胡敏酸组分含量和质量，可用作堆肥熟化度和化学稳定性的重要指标，也是堆肥安全利用与应用效果的保证。Romero等(2007)报道，堆肥过程能够改变类胡敏酸物质的化学特性和结构，脂肪、多肽和碳水化合物减少，而含氧和酸性官能团物质增加，最终与典型土壤胡敏酸相似。腐殖化过程促使形成脂肪族或芳香族羧酸官能团和酚类化合物，-COOH、酮基>C=O、芳香C=C(1771-1500 cm-1)和芳香族CH(3002-3820 cm-1)增加。200 P，300 P和400 P组分中这些官能团含量较高，表明施用堆肥的土壤，其胡敏酸组分中含有较多的腐殖物质。

本研究结果显示，腐殖化程度较高的组分，由于在极性溶液中变化较少，更容易发生沉淀。这就意味着随着腐殖化程度提高，由于-COOH基团和酚类化合物的存在，致使负电荷增加，极性增强。施用有机物料的水稻土，200 P、300 P、400 P和500 P组分含量增加，表明有机改良剂可增加水稻土腐殖化程度较高的胡敏酸组分。淹水水稻土中可交换性养分离子的有效性以及N矿化动力学特征，取决于有机碳底物的腐殖化程度。施用有机物料对水稻土的300 P组分含量影响更为显著(P≤0.05)，施用堆肥使300 P组分在总胡敏酸中的比例从对照土壤的34%提高到47%。热解气质联机分析结果表明，300 P组分的甲基酮和桂醛等化合物，分别来自碳水化合物和木质素，贡献率都在40%以上。可见，含碳的生物多聚物、简单的碳水化合物、复杂的木质素等，对于腐殖物质合成同等重要，施入水稻土后，均能够提高土壤稳定碳库。

致谢和参考文献(略)

译自：Science of the Total Environment，2014，(466-467)：952～956。

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