中有机酸的分析

一、目的及要求

了解HPLC在食品分析中的应用。

二、实验原理

在食品中，主要的有机酸是乙酸、乳酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸和酒石酸等。这些有机酸在水溶液中有较大的离解度。食品中有机酸的来源有三个：一是从原料中带来的，二是在生产过程中（如发酵）生成的，三是作为添加剂加入的。有机酸在波长210 nm附近有较强的吸收。苹果汁中的有机酸主要是苹果酸和柠檬酸。有机酸可以用反相HPLC、离子交换色谱、离子排斥色谱等多种液相色谱方法分析。除液相色谱外，还可以用气相色谱和毛细管电泳等其他色谱方法分析。

本实验按反相HPLC设计。在酸性（如pH 2～5）流动相条件下，上述有机酸的离解得到抑制，利用分子状态的有机酸的疏水性，使其在ODS固定相中保留。不同有机酸的疏水性不同，疏水性大的有机酸在固定相中保留强。本实验采用外标法中的一点工作曲线法定量苹果汁中的苹果酸和柠檬酸。

三、仪器与试剂

1.仪器

高效液相色谱仪（Agilent LC1200，美国），紫外检测器

超声器

2.试剂

苹果酸和柠檬酸标准溶液：准确称取优级纯苹果酸和柠檬酸，用蒸馏水分别配制1 000 mg／L的浓溶液，使用时用蒸馏水或流动相稀释5～10倍，两种有机酸的混合溶液（各含100～200 mg／L）用它们的浓溶液配制

磷酸二氢铵溶液（4 mmol／L）：称取分析纯或优级纯磷酸二氢铵，用蒸馏水配制，然后用0.45μm水相滤膜减压过滤

苹果汁：市售苹果汁用0.45μm水相滤膜减压过滤后，置于冰箱中冷藏保存

四、实验步骤

1.参照说明书开机，并使仪器处于工作状态。参考条件如下：Zorbax Eclipse XDB-C-18 150 mm×4.6 mm，5μm column P／N 993967-902；4 mmol／L磷酸二氢铵水溶液作流动相；流速1.0 mL／min；柱温30～40℃；紫外检测波长210 nm。

2.待基线稳定后，分别进苹果酸和柠檬酸标准溶液。

3.进苹果汁样品，与苹果酸和柠檬酸标准溶液色谱图比较即可确认苹果汁中苹果酸和柠檬酸的峰位置。如果分离不完全，可适当调整流动相浓度或流速。

4.进100～200 mg／L苹果酸和柠檬酸混合标准溶液。

5.设置好定量分析程序。用苹果酸和柠檬酸混合标准溶液分析结果建立定量分析表或计算校正因子。

6.按上述操作进苹果汁样品两次，如果两次定量结果相差较大（如5%以上），则再进样一次，取3次的平均值。

五、数据处理

数据处理见表8-3。

表8-3 实验数据记录表

六、注意事项

1.各实验室的仪器设备不可能完全一样，操作时一定要参照仪器的操作规程。

2.色谱柱的个体差异很大，即使是同一厂家的同型号色谱柱，性能也有差异。因此，色谱条件（主要是流动相配比）应根据所用色谱柱的实际情况作适当的调整。

七、思考题

1.假设用50%的甲醇或乙醇作流动相，你认为有机酸的保留值是变大，还是变小？分离效果会变好，还是变坏？请说明理由。

2.采用一点工作曲线的分析结果的准确性比多点工作曲线好，还是坏？为什么？

3.如果用酒石酸作内标定量苹果酸和柠檬酸，对酒石酸有什么要求？写出该内标法的操作步骤和分析结果的计算方法。