菌落总数的测定

实验十三　菌落总数的测定

一、实验目的

（1）学习平板菌落计数的基本原理和方法。

（2）熟练掌握基本无菌操作技术。

二、实验原理

细菌菌落总数测定一般采用平板菌落计数法，即将一定量待测样品充分稀释混匀（使细菌均匀分散），接种到牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，37℃培养一定时间后每个细菌形成肉眼可见的菌落。理论上统计菌落数，根据稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。实际上长出的单菌落可能来自样品中多个细胞，因此平板菌落计数的结果往往偏低。虽然该计数法操作较烦琐、时间较长，结果的准确性易受多种因素影响，但其优点在于可以获得活菌的信息，因此广泛应用于生物制品检验，以及食品、饮料和水样等含菌指数或污染度的检测。

三、实验器材

（1）试剂和培养基：无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

（2）设备和材料：恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平、均质器、振荡器、精密pH试纸、菌落计数器、无菌吸管（1mL、10mL）或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶（容量250mL、500mL）、无菌培养皿（直径9cm）。

四、实验步骤

（一）样品稀释

固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000～10 000rpm均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃± 1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

图13－1　菌落总数的检验程序

（二）培养

待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。

（三）菌落计数

肉眼观察，必要时用菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony－forming units，CFU）表示。选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表一个平板菌落数；当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计。

（四）计数

若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算：

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

一般计数原则：若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算；若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU 或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告；菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字；若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延；若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以CFU／g为单位报告，体积取样以CFU／mL为单位报告。

五、实验记录

将培养后菌落计数结果填入下表：

六、思考题

（1）为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？

（2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？

（3）同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？

（4）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。

参考文献

［1］肖明，王雨静．微生物学实验［M］．北京：科学出版社，2008．

［2］熊元林．微生物学实验［M］．武汉：华中师范大学出版社，2008．

［3］杨革．微生物学实验教程［M］．北京：科学出版社，2010．