形态观察与计数

实验六　酵母菌的培养、形态观察与计数

一、实验目的

（1）进一步学习并掌握光学显微镜低倍镜和高倍镜的使用方法。

（2）观察并掌握酵母菌的细胞形态。

（3）学习并掌握鉴别酵母菌细胞死活的方法和原理。

（4）学习并掌握血球计数板计数的原理。

（5）掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验原理

酵母菌：酵母菌细胞一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。酵母细胞核与细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十几倍。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，有些酵母能形成假菌丝。有性繁殖是通过接合形成子囊及子囊孢子。

（一）美蓝鉴别酵母菌死活细胞原理

美蓝是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。用美蓝对酵母细胞进行染色时，活细胞由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能将美蓝由蓝色的氧化态转变为无色的还原态，从而细胞呈无色；而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则由于细胞内还原力较弱而不具备这种能力，从而细胞呈蓝色，据此可对酵母菌的细胞死活进行鉴别。

（二）血球计数板计数原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。该方法是将菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间容积一定的计数室中，在显微镜下进行计数，然后根据计数结果计算单位体积内的微生物总数目。

血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0．1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0．1mm3。血球计数板的构造如图6－1。

图6－1　血球计数板的构造

计数时，通常数5个中方格的总菌数，再换算成1mL菌液中的总菌数。

三、实验器材

（1）材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）24～28h液体培养物。

（2）试剂：0．1%吕氏碱性美兰染色液、0．05%吕氏碱性美兰染液、乙醇－乙醚（3∶7，V／V）混合液。

（3）仪器：显微镜、擦镜纸、载玻片、血球计数板、盖玻片、接种环、酒精灯、镊子、计数器、电吹风等。

四、实验步骤

（一）美蓝染色观察酵母细胞形态和死活细胞的鉴别

（1）染色：在干净的载玻片中央加一小滴0．1%美蓝染色液，然后再加一小滴预先稀释至适宜浓度的酿酒酵母液体培养物，混匀后从侧面盖上盖玻片，并吸去多余的水分和染色液（注意染色液和菌液不宜过多或过少，应基本等量，且要混匀）。

（2）镜检：将制好的染色片置于显微镜的载物台上，放置约3min后进行镜检，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，根据细胞颜色区分死细胞（蓝色）和活细胞（无色），并进行记录。

（3）比较：染色约30min后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。

（4）用0．05%吕氏碱性美兰染液重复上述操作。

（二）酵母细胞计数

（1）菌悬液的制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母培养物制成浓度适当的菌悬液。

（2）加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细作用自动进入计数室（注意取样前要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生）。

（3）找计数室：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数（注意调节显微镜光线强弱，使菌体和计数室线条清晰）。

（4）显微镜计数：取左上、右上、左下、右下和中央5个中方格进行计数。位于中方格边线上的菌体一般只计上边和右边线上的（或只计左边和下边线上的）。如遇到酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半以上时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从上下两个计数室中得到的平均数值来计算样品的含菌量。

计数公式：

①1mL酵母菌液中的总菌数＝×104（个）

其中为两计数室五个中方格总菌数的平均值，B为菌液稀释倍数。

②出芽率（%）＝出芽细胞数／总菌数×100%

（5）清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察计数室内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止，吹干放回盒内。

五、实验记录

（一）酵母菌细胞形态的描绘

结果记录：图示美蓝染色结果，计算酵母菌死亡率，注明菌名与放大倍数。

（二）酵母细胞计数

将计数结果记录于表6－1、表6－2中，并用计数公式计算该菌液浓度和酵母细胞出芽率。

表6－1　用血细胞计数板对酵母菌悬液计数结果

表6－2　酵母菌出芽率

六、思考题

（1）吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？请分析其原因。

（2）能否用血球计数板在油镜下对细菌进行计数？为什么？

课后阅读

酵母菌子囊孢子的观察方法

酵母菌的有性繁殖一般产生子囊孢子，子囊孢子的形成与否及其数量和形状，是鉴定酵母菌的依据之一。在酵母菌的生活史中存在着单倍体阶段和双倍体阶段，这两个阶段的长短因菌种不同而有差异。在一般情况下，它们都持续地以出芽方式进行生长繁殖。但是如果将双倍体细胞移到适宜的产孢培养基上，其染色体就会发生减数分裂，形成含4个子核的细胞，原来的双倍体细胞即为子囊，而4个子核最终发展成子囊孢子。将单倍体的子囊逐个分离出来，经无性繁殖后即成为单倍体细胞。

（一）子囊孢子的培养

将酿酒酵母用新鲜麦芽汁琼脂斜面活化2～3代后，转接玉麦氏斜面培养基上，于25～28℃培养5～7d，可形成子囊孢子。

（二）制片与染色

在载玻片上滴一滴蒸馏水，取少许子囊孢子培养物于水滴中制成涂片，干燥固定后滴加孔雀绿染色液染色1min，弃去染液，用95%乙醇脱色30s，水洗，最后加沙黄液染色30s，水洗，用吸水纸吸干。

（三）镜检

用油镜观察，子囊孢子呈绿色，菌体和子囊呈粉红色。也可以不经染色直接制水浸片观察。水浸片中的酵母菌的子囊为圆形大细胞，内有2～4个圆形小细胞即为子囊孢子。

参考文献

［1］赵斌，何绍江．微生物学实验［M］．北京：科学出版社，2002．

［2］杨革．微生物学实验教程［M］．北京：科学出版社，2004．

［3］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［M］．3版．北京：高等教育出版社，1999．