种子细胞的形态学观察

一、固定细胞观察法

在细胞培养过程中，除了日常的肉眼观察和倒置显微镜下观察外，往往还需要做许多细胞生物学性状分析，因此，需要对细胞和培养的皮肤组织进行固定、染色。其优点有：一是可以进一步研究细胞的形态和超微结构；二是直观地显示其组织化学或免疫组织化学特性；三是可以长期保存，便于回顾性研究。

（一）培养细胞的固定

由于培养细胞用的瓶、皿在染色过程中操作不方便，因此常选择细胞爬片进行染色较方便，将盖玻片置入培养瓶中，待其表面附着单层细胞后，将玻片直接取出固定染色。另外可将细胞悬液滴到载玻片上，干燥固定后进行特殊染色。

细胞培养的是单层膜片或是细胞悬液，细胞层次少，固定剂容易透入细胞，固定效果好，所用的固定剂与一般固定组织的固定剂相同，通常采用以下几种固定剂，如无水乙醇、丙酮、甲醇／醋酸（3∶1）、FAA固定液［配方为80%乙醇90ml，加入醋酸和中性福尔马林（40%甲醛，同时向瓶内加过量MgCO3中和）各5ml］、中性缓冲福尔马林固定液［配方为福尔马林（40%甲醛，同时向瓶内加过量MgCO3中和）10ml、NaH2PO40．78g、 NaH2PO40．42g，并加入0．85%NaCl至100ml］和Carnoy固定液（配方为纯乙醇60ml、氯仿30ml、冰醋酸10ml）。其中，无水乙醇、丙醇适用于免疫组化染色时的固定；甲醇／醋酸应用最广，能维持细胞形态不变，最适于观察染色体；而Carnoy适于显示细胞化学成分（如黏多糖）的固定。

（二）培养细胞的常用染色方法

培养细胞可用各种方法染色，与其他正常组织细胞的染色方法相同。但有一般和特殊之分；一般染色为观察一般形态之用，特殊染色为用于观察细胞的特殊成分和结构的染色方法。常用普通染色法有吉姆萨染色法、苏木素－伊红（HE）染色法、阿尔辛蓝（AB）染色法、PAS染色法、甲苯胺蓝染色法、天狼星红苦酸染色法、碱性磷酸酶染色法、多巴染色法、ATP酶染色法、Feulgen染色法、吖啶橙染色荧光观察法等。吉姆萨染色是最常用的方法之一，它简便、快速，适用于多种细胞和染色体染色。

二、电子显微镜观察法

由于培养细胞具有层次薄和材料新鲜的特点，易于固定，固定效果好，最适合电镜观察。观察对象可以是培养的单层细胞原位切片，也可以是消化的细胞悬液，观察手段可以采用透射电镜或扫描电镜。原位观察时需要将细胞培养在无菌聚苯乙烯等制成的塑料薄膜或微孔滤纸、云母或卵壳膜上。消化成单细胞悬液做电镜观察时存在消化酶可能损伤细胞的表面结构，以及破坏细胞间相互接触关系的缺点。

三、培养细胞的免疫细胞化学技术

免疫组织化学染色已成为鉴定细胞种类、分子标志等的重要手段，目前已广泛用于细胞培养的研究中，其基本原理就是抗原抗体反应，用荧光素或酶等标记物或显色物标记特异性抗体，再与细胞内的抗原结合，形成带有荧光素或显示系统的抗原抗体复合物，使可以在荧光显微镜下或是显色反应后在普通显微镜观察到复合物的存在，达到检测细胞内抗原的目的。根据标记抗体的种类、使用次序及与抗原结合的方式和关系，可以分为直接法、间接法、桥联法等，根据显示系统的不同可分为免疫荧光法、酶标法、免疫金银法、ABC（卵白素－生物素复合法）及蛋白A法、放射免疫法等。其中，免疫荧光法和酶标法最为常用，而ABC法最为灵敏，非特性着色少，对比度佳。

免疫荧光法中常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明B200、吖啶橙等，FITC发黄绿色荧光，最大激发波长为495nm，最大发射荧光波长为525nm（490～619nm），罗丹明B200发橙红色荧光，最大激发波长为560nm，最大发射荧光波长为595nm（540～660nm），由于发射的荧光颜色不同，这两种荧光素常用于双标记染色时。吖啶橙发黄绿－橘红色荧光，最大激发波长为405nm，最大发射荧光波长为585nm（530～630nm）。荧光标记存在以下缺点：①需要价格昂贵的荧光显微镜；②荧光易衰减，标本不能保存，需要及时照相保存资料；③需要避光操作，须避免强光特别是紫外线照射。

免疫酶标法最常用的酶是辣根过氧化物酶（peroxidase，HRP），其他如碱性磷酸酶也有少量应用，辣根过氧物酶能够将底物DAB（3′3－二氨基联苯胺）氧化成棕黄色化合物，达到显色目的。它是把免疫反应和酶的高效催化作用有机地结合起来，具有免疫荧光法的优点，同时又克服了两者的缺点。表现出了以下优点：①用普通光学显微镜便可检测，易于推广；②能够用苏木素进行复染，使对比度更好；③可以长期保存；④不仅可用于光镜观察，也可以用于超微结构的研究。

PAP法（peroxidase－anti－peroxidase com－plex，PAP）是在间接法的基础上，采用预先结合好的可溶性酶－抗酶抗体复合物来取代桥联法的抗酶抗体和HRP两步反应，大大增加了敏感性，几乎可以与放射免疫测定（RIA）的敏感性相比。原因是PAP复合物由3个酶分子和2个抗酶抗体亚单位构成的复环形复合物，其稳定性很强，冲洗时不会脱落。

ABC法是利用卵白素（avidin）与生物素（biotin）具有高度亲和力的原理，一抗结合抗原后，再通过生物素标记的二抗与一抗结合，然后ABC复合物（标有HRP）与生物素化二抗结合，形成抗原－抗体－生物素化二抗－ABC复合物。本法比PAP法更灵敏。

直接法是将荧光素或酶标记在一抗上，直接结合抗原，具有特异性强、需时短、简便的优点，但灵敏度较低，须标记每一种抗体，抗体需要量大。间接法是将显示系统标记在二抗上，二抗是一抗的抗核抗体，从而能显示许多抗原，提高了灵敏度，但非特异性略高。桥联法是一抗与抗原结合后，滴加一个过量的“桥”抗体，后者的一半Fab片断结合一抗，另一半结合酶标三抗，本法染色效果不好，已很少用。

免疫组化染色中须注意以下几个环节，一是选择最佳固定方法，免疫组化固定的基本要求是在保持细胞形态完好和所检测抗原的前提下，使用最低浓度的固定液和最短的固定时间。培养的细胞选用无水乙醇或纯丙酮固定最好。二是必须设置阳性和阴性对照，以排除相关因素的影响，阳性对照的目的是证实抗体的特异性，阴性对照采用PBS或同种非免疫动物的血清，观察其非特异性情况。三是选择抗体的最佳稀释浓度，目的是提高染色的阳性率，获得染色的良好对比，避免假阴性结果，往往采用阳性标本来摸索条件，2种以上的抗体需要采用排列组合的方法来确定2种抗体间的最佳浓度。四是确定抗体的孵育条件，一般来讲，一抗置4℃冰箱中过夜较好，可以增强特异染色，减少非染色性反应，二抗和三抗置室温中孵育15～ 60min，孵育应在湿盒内进行。五是严格控制显色时间，DAB显色时应在光镜下观察最佳显色时间，一般显色时间在5min内。六是操作过程要洗涤充分，要注意避免抗体的交叉反应，不可用同一PBS容器洗涤。七是要用3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶的活性。八是苏木素复染时要适度，不可过浅或过深。九是及时封片、观察和照相，尤其是荧光素显示时要及时照相。

（伍津津　杨亚东）

参 考 文 献

［1］杨景山．医学细胞化学与细胞生物技术．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990：92－114

［2］司徒镇强，吴军正．细胞培养．西安：世界图书出版社，1996：169－210